Polimorfizm locus DXS1062 w populacji polskiej

Z Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej AM w Gdańsku

Kierownik: dr hab. Z. Szczerkowska – profesor AM

W pracy przedstawiono dane populacyjne dla dwunukleotydowego locus typu STR – DXS1062 sprzężonego z chromosomem X. Badaniom poddano 161 dorosłych niespokrewnionych osób (kobiet i mężczyzn), mieszkańców Polski północnej. W analizowanej populacji wykazano 21 różnych fenotypów i 9 różnych alleli. Allele te poddano sekwencjonowaniu, skonstruowano z nich drabinę i zaproponowano ich nazewnictwo zgodnie z wytycznymi komisji ISFG. Najczęściej występowały allele 20 i 21. Obliczono parametry statystyczne. Uzyskana wysoka siła dyskryminacji, szansa wykluczenia ojcostwa, siła wykluczenia, jak również korzystna zawartość informacji genetycznej czynią badany układ przydatnym markerem w genetyce sądowej.

This paper presents the results of a population study of a dinucleotide STR marker DXS1062. Blood samples were obtained from unrelated adult individuals (males and females) living in the northern part of Poland. In the analyzed population, 21 different phenotypes and 9 alleles of the DXS1062 locus were found. The alleles were sequenced and used for the construction of an allelic ladder. The nomenclature in accordance with ISFG guidelines was proposed. The most frequent alleles were 20 and 21. Statistical parameters (PR, PM, PD, PIC) showed that the examined system is useful in forensic medicine.

Słowa kluczowe: STR, chromosom X, locus DXS1062, genetyka populacyjna

Key words: STR, X chromosome, locus DXS1062, population genetics

WSTĘP

W ciągu ostatnich lat STR–y stały się nieodzownym narzędziem badawczym w genetyce sądowej. Szeroko podkreślane jest znaczenie autosomalnych markerów DNA chromosomu Y. Zdecydowanie mniej publikacji poświęcono dotąd polimorfizmowi chromosomu X, który może być bardzo przydatny w analizie niektórych spraw sądowych. Należą do nich np. przypadki ustalenia pokrewieństwa między babcią a wnuczką, a także sprawy o dochodzenie ojcostwa, gdy spornym dzieckiem jest dziewczynka. Mężczyzna przekazuje chromosom X wszystkim swoim córkom, a ponieważ jest hemizygotą pod względem tego chromosomu, średnia szansa wykluczenia ojcostwa w oparciu o analizę markerów chromosomu X może być wyższa niż dla autosomalnych loci (4).

Do tej pory w locus DXS1062 zidentyfikowano 9 alleli (18–26) obejmujących wielkość od 97–111pz. Jednostkę repetytywną stanowi sekwencja dwunukleotydowa (CA)_n.

MATERIAŁ I METODY

DNA izolowano z krwi obwodowej pobranej na antykoagulant EDTA (1,5 mg/ml) oraz ze śliny 161 niespokrewnionych osób mieszkańców Polski północnej. Do ekstrakcji DNA zastosowano nieenzymatyczną metodę wg Lahiri (5) oraz zestaw "Sherlock AX” f-my A&A Biotechnology. Stężenie DNA oznaczono metodą detekcji fluorymetrycznej (Fluoroskan Ascent FL, ThermoLabsystems) z zastosowaniem odczynnika PicoGreenŽds DNA Quantitation Kit f-my Molecular Probes (9).

45–52 ng genomowego DNA amplifikowano przy użyciu termocyclera GeneAmpŽ PCR System 9700 f-my Applied Biosystems stosując komercyjny zestaw do amplifikacji ABI PRISM Linkage Mapping Sets v2.5 – MD10 Panel 84 f-my Applied Biosystems (6, 7).

Mieszanina reakcyjna dla locus DXS 1062 o całkowitej objętości 15 ľl zawierała:

10x GeneAmpŽ PCR Buffer –1,5ľl

Nukleotydy (200 ľM dNTP) –1,5ľl

Primer mix (5ľM każdy primer) –1,0ľl

25 mM MgCl₂ –1,5ľl

AmpliTag GoldŽ DNA Polimerase (5U/ľl) –0,12ľl

woda destylowana –8,18ľl

DNA (45–52 ng) –1,2ľl

Amplifikację prowadzono w następujących warunkach:

• 12 min. wstępna denaturacja w 95°C
• 10 cykli (15 s w 94°C, 15 s w 55°C, 30 s w 72°C),
• 20 cykli (15 s w 89°C, 15 s w 55°C, 30 s w 72°C)
• 10 min końcowego wydłużania nici DNA w 72°C.

Po amplifikacji produkt PCR (0,5 ľl) zmieszano z 0,15 ľl wewnętrznego standardu wielkości GeneScan^TM–500 LIZ^TM (Applied Biosystems) i 12 ľl dejonizowanego formamidu, po czym przeprowadzono denaurację w 95°C przez 5 min i szybko umieszczano w lodzie. Po 5 sekundowym nastrzyku produkty rozdzielano metodą elektrofororezy kapilarnej na automatycznym sekwenatorze ABI Prism 310 (Applied Biosystems) przez 24 min w 60°C przy 15 kV przy zastosowaniu polimeru POP–4 oraz kapilary o długości 47 cm i 50 ľm średnicy.

Wyniki analizowano przy użyciu programu komputerowego GeneScan Analysis Software wer. 3.7 (Applied Biosystems), CEPH control DNA 1347–02 (Applied Biosystems), NCBI Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) oraz CEPH Genotype Database (http://www.cephb.fr/cephdb).

W celu skonstruowania drabiny alleli dla badanego locus sekwencjonowaniu poddano próbki z wybranymi allelami, pochodzące od mężczyzn, różniące się pomiędzy sobą wielkościami fragmentów. Każdy badany allel oddzielnie poddano ponownej amplifikacji, przy czym objętość mieszaniny reakcyjnej zwiększono do 20 ľl. Produkty amplifikacji oczyszczano ze starterów i nukleotydów na kolumienkach Microcon YM–100 (Millipore). Do każdego amplifikatu dodano 480 ľl wody HPLC i poddano wirowaniu. Po zwirowaniu przesącz odrzucano, a supernatanty uzupełniano po 450 ľl wody HPLC każdy i ponownie wirowano w tych samych warunkach. Następnie kolumienki umieszczano w nowych jałowych probówkach i wirowano. Stężenie oczyszczonych produktów oznaczono metodą detekcji fluorymetrycznej (Fluoroskan Ascent, Thermolabsystems) z zastosowaniem odczynnika PicoGreenŽdsDNA Quantitation Kit f-my Molecular Probes.

Do sekwencjonowania wykorzystano stosując zestaw ABI Prism BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kits. Stosowano 5 ng każdego badanego produktu, 1.6 pmol nieznakowanego fluorescencyjnie primera P^R o sekwencji 5’– GTT GCC TGT TAA GCA CTT TGA ATC–3^’ w łącznej objętości 10 ľl.

Reakcja sekwencjonowania przeprowadzono w następujących warunkach:

• 12 min wstępna denaturacja w 95°C
• 10 cykli (15 s w 94°C, 15 s w 55°C, 30 s w 72°C),
• 20 cykli (15 s w 89°C, 15 s w 55°C, 30 s w 72°C)
• 10 min końcowego wydłużania nici DNA w 72°C.

Produkty sekwencjonowania oczyszczano przez precypitację 95% etanolem w obecności 3M octanu sodu. Po 20 min precypitacji w temperaturze pokojowej próbki wirowano przy 14 tys. rpm przez 20 min. Usuwano supernatanty, a produkty przemywano 70% etanolem. Po zworteksowaniu i zwirowaniu etanol usuwano, a produkty suszono w 90°C przez 1 min. i zawieszano w 12 ľl dejonizowanego formamidu.

Po dwuminutowej denaturacji w 95°C próbki szybko schładzano w lodzie. Tak przygotowane produkty rozdzielano metodą elektroforezy kapilarnej na sekwenatorze ABI Prism 310, w kapilarze 47 cm x 50 ľm wypełnionej denaturującym polimerem POP–6 (Applied Biosystems) przy nastrzyku 2 kV przez 30 s i późniejszym rozdziale przez 28 min przy 15 kV.

Do analizy uzyskanych wyników zastosowano program komputerowy Sequencing Analysis 3.7 (Applied Biosystems).

WYNIKI I DYSKUSJA

Rozkład częstości alleli locus DXS1062 w analizowanej populacji z terenu Polski północnej przedstawiono w tabeli I.

Tabela I. Rozkład alleli locus DXS1062 w populacji Polski północnej.

Table I. Distribution of DYS1062 alleles in the northern Polish population.

W DNA 161 badanych osób wykazano 9 różnych alleli locus DXS1062 z 10 do tej pory zidentyfikowanych. Najczęstszymi były allele 20 i 21.

W oparciu o wyniki badań populacyjnych obliczono parametry charakteryzujące przydatność locus DXS1062 w medycynie sądowej: w badaniach identyfikacyjnych oraz w dochodzeniu ojcostwa i zestawiono je w tabeli II.

Tabela II. Parametry wskazujące na przydatność locus DXS1062 w medycynie

sądowej.

Table II. Statistical parameters of the usefulness of the DXS1062 locus in

forensic medicine.

Powyższe parametry, a szczególnie wysoka wartość siły dyskryminacji a także wysoki stopień polimorfizmu decydują o dużej przydatności badanego układu w medycynie sądowej. Porównanie homogenności rozkładu alleli locus DXS1062 pomiędzy danymi z populacją Polski północnej oraz populacją kaukaską (1) wykazało brak różnic w ich rozkładzie.

PISMIENNICTWO

1. CEPH Genotype Database (http://www.ceph.fr/cephdb). –2. Desmarais D., Zhong Y., Chakraborty R., Perreault C., Busque L.: Development of a highly polymorphic STR marker for identity testing purposes ate the human androgen receptor gene (HUMARA). J. Forensic Sci. 1998, 43, 1046–1049. –3. DNA recommendations-further report of the DNA Commission of the ISFG regarding the use of short tandem repeat systems. Forensic Sci. Int. 1997, 87, 179–184. –4. Edelmann J., Deichsel D., Hering S., Plate I., Szibor R.: Sequence variation and allele nomenclature for the X-linked STRs DXS 9895, DXS 8378, DXS 7132, DXS 6800, DXS 7133, GATA 172DO5, DXS 7423 and DXS 8377. Forensic Sci. Int. 2002, 129, 99–103. –5. Lahiri D., Bye S., Nurnberg J.: A rrapid non-enzymatic method for the preparatin of HMW DNA form blood for RFLP studies. Nucleic Acids Research, 1991, 19, 5444. –6. Matsushita H., Nakamura S., Nagai T., Nakamura M., Sugite H., Furukawa M., Komuro T., Kurihara K.: Allele frequencies of dinukleotide repeat loci on the X chromosome in the Japanese populatin. Forensic Sci. Int. 2002, 129, 134–136. –7. PE Applied Biosystems ABI PRISM Linkage Mapping Set (Version 2): User^'s Manual 2003. –8. Protocol– Applied Biosystems ABI PRISM^Ž BigDye^™Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits. –9. Rębała K., Szczerkowska Z.: Identyfikacja bardzo krótkiego allela YCAII w populacji północnej Polski. Arch. Med. Sąd. Krym., 2004, 54, 1, 17–24.

Adres pierwszego autora,

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej AM

ul. Dębowa 23

80–210 Gdańsk