Zofia Olszowy

Badania doświadczalne nad przebiegiem zatrucia glikolem etylenowym w aspekcie toksykologicznym i medyczno-sądowym. Cz. 3. Badania
mikroskopowe w ostrym i podostrym zatruciu
glikolem etylenowym

Experimental investigations on the course of ethylene glycol poisoning from a medico-legal and toxicological aspect. Part 3. Microscopic examination in acute and subacute ethylene glycol poisonings

Z Katedry Medycyny Sądowej Śląskiej AM w Katowicach

Kierownik: prof. dr hab. H. Sybirska

Badania mikroskopowe miały na celu wykazanie zmian patologicznych w narządach wewnętrznych zwierząt, którym podano glikol etylenowy jednokrotnie i przez 28 dni w trzech zróżnicowanych dawkach 1/2,1/10,1/100 DL₅₀/kgmc. Obserwowane zmiany miały charakter zaburzeń w krążeniu, zmian wstecznych, postępowych i zapalnych. W doświadczeniu ostrym zmiany te były słabo zaznaczone i występowały u pojedynczych szczurów w grupach. Wymieniane zmiany przede wszystkim manifestowały się w narządach zwierząt zatruwanych glikolem etylenowym przez 28 dni. W wątrobie, nerkach, mózgu a także wcześniej zebranych porcjach moczu zatrutych szczurów potwierdzono obecność kryształów szczawianu wapnia. Obserwacje prowadzono w mikroskopie świetlnym, świetle spolaryzowanym a także w mikroskopie elektronowym. Wielkość i ilość kryształów w preparatach była zróżnicowana. Różnice te pozostawały w związku z wielkością podawanej dawki glikolu, rodzajem zatrucia (ostre, podostre) a także czasem jaki upłynął od podania ksenobiotyku.

The aim of microscopic examination was to show lesions in internal organs of the rats which were administrated ethylene glycol once and in 3 different doses: 1/2,1/10 and 1/100 DL₅₀/kgbm within 28 days. Lesions were found to be: retrogressive, progressive, inflammatory or sometimes they were circulatory disturbances. In an acute experiment these lesions were rather not very visible and they appeared in single rats, especially those after a 28-day dose of ethylene glycol. Calcium oxalate crystals were found in the liver, kidneys, brain and urine of the poisoned rats. Microscopic examination was carried out using polarized-light and electron microscopes. The size and quantity of calcium oxalate crystals in microscopic specimens were different. The observed differences were connected with the size of ethylene glycol dose, the type of poisoning (acute, subacute) and time from xenobiotic administration to the examination.

Słowa kluczowe: zatrucie ostre i podostre glikolem etylenowym, zmiany morfologiczne, kryształy szczawianu wapnia.

Key words: acute and subacute ethylene glycol poisoning, morphologic changes, calcium oxalate crystals.

Glikol etylenowy, podobnie jak etanol, ma działanie narkotyczne (6, 23). W zatruciu tym dwuwodorotlenowym alkoholem szczególne znaczenie mają jego metabolity (aldehyd glikolowy, kwas glikolowy, kwas glioksalowy, kwas szczawiowy), które mogą być przyczyną ciężkich uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego, nerek i innych narządów wewnętrznych (8, 9,10, 12, 22).

W pośmiertnym rozpoznaniu zatrucia glikolem etylenowym, dla medyka sądowego a także klinicysty, obok badań toksykologicznych znaczącą rolę spełniają badania histopatologiczne (7, 17, 19). Z danych literaturowych oraz własnych obserwacji, w przypadkach zatruć śmiertelnych glikolem, mikroskopowo stwierdza się w mózgu: obrzęk, przekrwienie, krwawe wybroczyny, drobne nacieki oraz kryształy szczawianu wapnia w przestrzeni podpajęczczynówkowej mózgu a także tkance mózgowej. W płucach: obrzęk, krwawe wybroczyny śródmiąższowe i opłucnowe (17, 19, 21). Ponadto zmiany zwyrodnieniowe mięśnia sercowego, wątroby i nerek. W nerkach uwagę zwracają wybroczyny krwawe i drobne nacieki, stłuszczenie kropelkowe, obecność wałeczków ziarnistych i hemoglobinowych. Kryształy szczawianu wapnia stwierdza się w świetle kanalików nerkowych, śródkomórkowo w komórkach kanalików nerkowych, w nabłonku cewek, w świetle drobnych naczyń. Ich obecność stwierdza się także w żyłach centralnych miąższu wątroby (2, 5, 14, 22).

Zmiany patologiczne i ich nasilenie zależne są od wielu czynników, przede wszystkim od ilości spożytego glikolu etylenowego, czasu intoksykacji, czasu jaki upłynął od spożycia trucizny do zejścia śmiertelnego (1, 6, 9, 13, 12, 19). Obserwowane zmiany morfologiczne nie są charakterystyczne. W zatruciu glikolem etylenowym za charakterystyczne można uznać jedynie obecność kryształów szczawianu wapnia (8, 14). Za czynnik warunkujący kliniczny obraz zatrucia, długo uznawano nagromadzenie szczawianów wapnia (3, 14, 22, 10). Kwas szczawiowy jest związkiem o wysokiej toksyczności. Spożyty w czystej postaci powoduje rozległe uszkodzenie nerek, silną kwasicę, szybką śmierć. Letalna dawka szczawianów dla człowieka wynosi 0,1g/kgmc (11, 20) i jest wielokrotnie niższa od dawki letalnej glikolu etylenowego - 1,4g/kgmc (4). Szczawian wapnia praktycznie nie jest metabolizowany. Jego eliminacja z organizmu następuje przez układ moczowy. Wydalanie szczawianów jest powolne i może trwać od 2 do 6 tygodni a nawet dłużej (3, 7, 17).

Materiał i metody

Badania wykonano na szczurach szczepu Wistar, w wieku 3 miesięcy i ciężarze 180-200g. Zwierzęta podzielono losowo na dwie grupy główne z przeznaczeniem do doświadczenia ostrego i testu 28-dniowego. W obrębie grup głównych wyodrębniono 3 grupy liczące po 21 samic i 21 samców, którym w doświadczeniu ostrym sondą dożołądkowo, podano jednokrotnie glikol etylenowy w dawkach 1/2, 1/10, 1/100 DL₅₀/kgmc. W doświadczeniu podostrym identyczne ilości glikolu podawano codziennie przez 28 dni. Dwóm grupom kontrolnym liczącym po 14 samic i 14 samców podawano wodę. W czasie 26-godzinnej obserwacji materiał do badań histopatologicznych pobrano siedmiokrotnie (18).

Szczury dekapitowano i wykonywano szczegółowe badania sekcyjne. Do badań histopatologicznych pobierano następujące narządy: mózg, serce, płuca, wątrobę, śledzionę, nerki, nadnercza, żołądek, dwunastnicę, gonady (jądra, jajniki). Pobrany materiał utrwalano w 10% roztworze formaliny a następnie poddano obróbce techniką parafinową. Preparaty te barwiono hematoksyliną i eozyną. Oceniano w mikroskopie w świetle zwykłym i spolaryzowanym. Do mikroskopii elektronowej skaningowej wycinki z narządów (wątroba, nerka, mózg) utrwalano w 2,5% roztworze glutaraldehydu w buforze kakodylowym i 1% roztworze czterotlenku osmu na buforze kakodylowym. Proces odwadniania i osuszania prowadzono w szeregu acetonowym do pełnego acetonu. Ostatni etap suszenia w tzw. punkcie krytycznym.

Osad z zebranych porcji moczu oceniono pod kątem obecności kryształów szczawianowych.

Wyniki i ich omówienie

Zmiany patologiczne, jakie obserwowano w narządach wewnętrznych zwierząt intoksykowanych glikolem etylenowym, były zależne od wielkości stosowanych dawek oraz rodzaju zatrucia (ostre, podostre). Zależność ta uwidoczniła się już w czasie badań sekcyjnych. Makroskopowo u 8 szczurów (6 ♂, 2 ♀) obciążonych jednorazowo glikolem w dawce 1/2 DL₅₀ stwierdzono w niewielkim stopniu powiększenie nerek. Po tej samej dawce w doświadczeniu podostrym u 28 zwierząt (18 ♂, 10 ♀) nerki były wyraźnie powiększone, barwy szarożółtej i o ziarnistej powierzchni. Również wątroba u szczurów w tej grupie wykazywała żółtawe zabarwienie. Podobny charakter zmian obserwowano u 4 samców zatruwanych dawką 1/10 DL₅₀ glikolu. Takich zmian makroskopowych nie stwierdzono u zwierząt w grupach kontrolnych.

W obrazie mikroskopowym narządów wewnętrznych zatrutych zwierząt stwierdzono szereg zmian patologicznych. Zmiany te jednak były mało zróżnicowane i nie miały cech swoistych. Miały one charakter zmian wstecznych, postępowych i zapalnych. Dominowały zaburzenia w układzie krążenia w postaci przekrwienia i krwinkotoków. Ich nasilenie wzrastało proporcjonalnie do wielkości podawanych dawek. Zaburzenia w układzie krążenia dotyczyły w szczególności mózgu serca, nerek i wątroby. Obserwowane one były także u zwierząt kontrolnych, prawdopodobnie jako następstwo zaburzeń agonalnych (11). Wyraźne jednak ich nasilenie u zwierząt zatrutych glikolem, zwłaszcza w doświadczeniu podostrym, przemawia za tym, że czynnikiem sprawczym tych zmian mógł być również glikol. Obserwowany efekt skumulowanego działania czynnika toksycznego mogą tłumaczyć znamiennie wyższe stężenia glikolu i jego metabolitów, oznaczone w tkankach zwierząt zatruwanych przez 28 dni (18). Zmiany w układzie krążenia u szczurów w doświadczeniu ostrym, uchwycone w 6 godzinie po intoksykacji, nie uległy nasileniu w miarę upływu czasu.

Zmiany zapalne ujawnione w płucach często miały charakter zapalenia ropnego zwłaszcza u zwierząt w doświadczeniu podostrym. Nie były one skorelowane z wielkością podawanej dawki ksenobiotyku. Ropne zapalenie płuc jest częstym powikłaniem chorobowym obserwowanym u szczurów laboratoryjnych (11, 16). Zmiany tej nie można łączyć etiopatologicznie z zatruciem glikolem etylenowym. Podobnie nie należy łączyć z toksycznym działaniem glikolu występujących w płucach nacieków komórek piankowatych. Jest to bowiem typowe dla toczących się w płucach szczurów laboratoryjnych nieswoistych procesów zapalnych (16).

Zmiany wsteczne obserwowano głównie w narządach miąższowych (wątroba, nerki) w postaci zwyrodnienia tłuszczowego, wodniczkowego, wałeczków szklistych. Obraz mikroskopowy w zakresie tych zmian był wyraźnie zależny od ilości podanego glikolu i czasu narażenia (5, 7, 9, 23).

Kolejną grupę zmian stanowiły zmiany postępowe obserwowane w wątrobie pod postacią rozrostu komórek Browicza-Kupffera. W pojedynczych przypadkach stwierdzono również nacieki komórkowe w przestrzeniach wrotnych. Nasilenie obserwowanych zmian było skorelowane z wielkością dawki glikolu. W wątrobie szczurów kontrolnych na ogół zmian nie było.

W mięśniu sercowym przekrwienie, krwinkotoki obserwowano u wszystkich zwierząt w doświadczeniu ostrym i podostrym. Nasilenie ich było większe u szczurów zatruwanych glikolem. U jednego szczura, samca w doświadczeniu podostrym, w grupie otrzymującej dawkę 1/10 DL₅₀, stwierdzono ropne zapalenie osierdzia.

W śledzionie 6 szczurów: jednego z grupy, w której podawano dawkę 1/2 DL₅₀ i pięciu 1/100 DL₅₀, obserwowano złogi hemosyderyny. Przekrwienie śledziony stwierdzono tylko u jednej samicy z grupy zatruwanej dawką 1/10 DL₅₀.

W mózgowiu obserwowano zaburzenia w układzie krążenia manifestujące się przekrwieniem i krwinkotokami. Szczególne nasilenie tych zmian występowało po dawce najwyższej i było wyraźnie większe u szczurów w doświadczeniu podostrym.

Szczególną uwagę zwracają zmiany w nerkach. Polegały one na uszkodzeniu nerczycowym kanalików nerkowych. Kanaliki swoim wyglądem przypominały pęcherzyki tarczycy, w świetle których widoczne były wałeczki szkliste i kryształy szczawianu wapnia. Podobne zmiany obserwowane były u ludzi zatrutych glikolem (14, 19, 21). Szczegółowe zmiany morfologiczne w wyżej wymienionych narządach przedstawiono w tabeli I i II.

W pozostałych badanych narządach (żołądek, dwunastnica, nadnercza, gonady) zmian patologicznych nie obserwowano.

W diagnostyce zatruć glikolem etylenowym duże znaczenie ma wykazanie obecności kryształów szczawianu wapnia w narządach wewnętrznych głównie jednak w nerkach (1, 14, 17, 19, 21, 24). Stwierdzano je w świetle kanalików nerkowych, śródkomórkowo w komórkach kanalików. Ich ogólna ilość skorelowana była z wielkością podawanych dawek glikolu co potwierdzają obserwacje Li i wsp. (15) i innych (14). Kryształy szczawianu wapnia w preparatach barwionych hematoksyliną-eozyną i ocenianych w mikroskopie świetlnym, stwierdzone były u większości szczurów zatrutych dawkami 1/2 i 1/10 DL₅₀ (ryc. 1).

Ryc. 1. Nerka - kryształy szczawianu wapnia. Dawka 1/10 DL₅₀/kgm.c. glikolu etylenowego. Doświadczenie podostre (samica). Barwienie H-E. Powiększenie 130x.

Fig. 1. Kidney - calcium oxalate crystals. Ethylene glycol dose of 1/10 DL₅₀/kgb.m. Subacute experiment (female). H-E stain. Enl 130x.

W mikroskopie optycznym w zwykłym świetle nie potwierdzono obecności szczawianów w mózgu i w wątrobie zatrutych glikolem szczurów. Nie były też widoczne w nerkach zwierząt otrzymujących najniższą dawkę glikolu (1/100 DL₅₀). Potwierdzenie ich obecności było możliwe dopiero w świetle spolaryzowanym a przede wszystkim za pomocą mikroskopu skaningowego (ryc. 2, 3, 4) (20).

Ryc. 2. Wątroba - najczęściej spotykany obraz, potwierdzający obecność kryształów szczawianu wapnia. Dawka 1/100 DL₅₀/kgm.c. glikolu etylenowego. Doświadczenie podostre (samiec). SEM. Pow. 5000x.

Fig. 2. Liver - the most common picture of calcium oxalate crystals. Ethylene glycol dose of 1/100 DL₅₀/kgb.m. Subacute experiment (male). SEM. Enl. 5000x.

Ryc. 3. Mózg - kryształy szczawianu wapnia. W tkance mózgowej sporadycznie spotykano pojedyncze agregaty kryształów. Dawka 1/2 DL₅₀/kgm.c. glikolu etylenowego. Doświadczenie podostre (samiec). SEM. Pow. 2500x.

Fig. 3. Brain - calcium oxalate crystals. Single aggregates of crystals were found rarely in brain tissue. Ethylene glycol dose of 1/2 DL₅₀/kgb.m. Subacute experiment (male). SEM. Enl. 2500x.

Ryc. 4. Kryształy szczawianu wapnia tworzące bardzo zróżnicowane kompozycje. Dawka 1/2 DL₅₀/kgm.c. glikolu etylenowego. Doświadczenie podostre (samica). SEM. Pow. 500x.

Fig. 4. Kidney - different clusters of calcium oxalate crystals. Ethylene glycol dose of 1/2 DL₅₀/kgb.m. Subacute experiment (female). SEM. Enl. 500x.

Ryc. 5. Kryształy szczawianu wapnia w porcji moczu zebranego o godzinie 14⁰⁰ od szczura (samca), któremu podano glikol etylenowy w dawce 1/2 DL₅₀/kgm.c. Doświadczenie ostre. Pow. 320x.

Fig. 5. Calcium oxalate crystals in urine collected from a rat (male) at 2 p.m. after ethylene glycol administration in a dose of 1/2 DL₅₀/kgb.m. Acute experiment. Enl. 320x.

Ryc. 6. Kryształy szczawianu wapnia w porcji moczu zebranego o godzinie 14⁰⁰ od szczura (samca), któremu podano glikol etylenowy w dawce 1/2 DL₅₀/kgm.c. Doświadczenie podostre. Pow. 320x.

Fig. 6. Calcium oxalate crystals in urine collected from a rat (male) at 2 p.m. after ethylene glycol administration in a dose of 1/2 DL₅₀/kgb.m. Subacute experiment. Enl. 320x.

W mikroskopie optycznym drobne kryształy mogą być niewidoczne, dlatego celowe były ich poszukiwania w świetle spolaryzowanym (19, 24) a także mikroskopie elektronowym. Eliminacja szczawianów z organizmu następuje przez układ moczowy (7). Ilość szczawianów, która była wydalana z moczem a także ich wielkość zależała od ilości podanego glikolu i rodzaju zatrucia. Rozmiary kryształów były zróżnicowane - od dziesiątych części mikrometra do kilkudziesięciu mikronów (ryc. 5, 6).

Wnioski

1. Obserwowane zmiany patologiczne w preparatach histologicznych z narządów wewnętrznych zwierząt, zatruwanych glikolem etylenowym, nie miały cech swoistych. Miały one charakter zmian wstecznych i odczynowych ostrych (w układzie krążenia: przekrwienia, krwinkotoki) a także postępowych. Zależne były od wielkości i wielokrotności podawanych dawek. Zmiany odczynowe ostre były widoczne przede wszystkim w pierwszych godzinach doświadczenia, wsteczne zaś przy dłużej trwającym toksycznym działaniu glikolu i jego metabolitów. Zmiany postępowe pojawiły się w wątrobie szczurów pod postacią rozrostu komórek Browicza-Kupffera.

2. Obecność kryształów szczawianu wapnia w nerkach, mózgu i wątrobie, nawet po najmniejszej dawce glikolu (w doświadczeniu ostrym i podostrym), można było potwierdzić w mikroskopie elektronowym skaningowym.

3. W osadzie moczu, zebranym w określonych przedziałach czasowych, największe ilości kryształów szczawianowych obserwowano w pierwszej porcji moczu. Wielkość i ilość kryształów były zależne od podanej dawki glikolu etylenowego i rodzaju zatrucia (ostre i podostre).

Piśmiennictwo:

1. Boeve E.R., Ketelaars G.A., Vermeif M., Cao L.C., Schroder F.H., De-Bruijn W.C.: An ultrastructural study of experimentally induced microliths in rat proximal and distal tubules. J.Urol., 1993, 194 (4), 893-899. -2. Bogdanik T.: Kontrowersje i trudności związane z ostrymi zatruciami alkoholem metylowym i glikolem etlenowym. Stud. Mat. Monogr. IMP, Łódź, 1983, 2 (15), 36-45. -3. Clay K.L., Murphy R.C.: On the metabolic acidosis of ethylene glycol intoxication. Toxicol. Appl. Pharmacol., 1977, 39, 39-49. -4. Dutkiewicz T.: Chemia toksykologiczna. PZWL, Warszawa, 1974, 159-161. -5. Frederick E.W., Rabkin M.T., Richie R.H., Smith L.H.: Studies on primary hyperoxaluria. N. Engl. J. Med., 1963, 269, 821-824. -6. Grzeszczak W., Szurkowski M.: Przypadek długotrwałej śpiączki spowodowanej zatruciem glikolem etylenowym. Pol. Tyg. Lek., 1985, XL, 229-230. -7. Hewlett T.P., Jacobsen D., Collins T.D., McMartin K.E.: Ethylene glycol and glycolate kinetics in rats and dogs. Vet. Hum. Toxicol., 1989, 31, 116-120. -8. Jacobsen D., Ostby N., Bredesen J.E.: Studies on ethylene glycol poisoning. Acta Med. Scand., 1981, 212,11-15. -9. Jacobsen D., Øvrebø S., Õstborg J., Sejersted O.M.: Glycolate causes the acidosis in ethylene glycol poisoning and is effectively removed by hemodialisis. Acta Med.. Scand., 1984, 216, 409-416. -10. Kaiser W., Steimauer H.G., Biesenbach G., Janko O., Zazgornik J.: Chronic ethylene glycol poisoning. Dtsch. Med. Wochenschr. 1993, 118 (17), 622-626.

11. Kita K., Kołodziejczyk E.: Ocena przydatności szczurów szczepu Wistar hodowli komercyjnej do przewlekłych badań toksykologicznych. Zwierzęta Laboratoryjne 1974, XL, 1-2, 17-29. -12. Klimek D., Więcek A., Kokot F.: Czy można przeszczepić nerki pobrane od osób zmarłych po zatruciu glikolem etylenowym? Pol. Arch. Wew., 1993, 89 (2), 178-183. -13. Kuska J., Kokot F., Koziak M., Fojt T., Nowicki M., Marcinkowski W.: Zatrucie glikolem etylenowym. Wiad. Lek., 1988, 41 (12), 780-789. -14. Levy R.: Renal failure secondary of ethylene glycol intoxication. JAMA, 1960, 173,1210. -15. Li L.C., Zhang Y.S., Hu R.Z., Zhau X.C.: Inhibitory effect of fluoride on renal stone formation in rats. Urol. Int., 1992, 48 (3), 336-341. -16. Luciak M., Kita K., Kita J.: Wpływ wieku na obraz morfologiczny płuc u szczurów. Zwierzęta laboratoryjne, 1982, 19, 1-2, 165-168. -17. Mądro R., Gąsior M.: Ostre zatrucia glikolem etylenowym. Arch. Med. Sąd. Krym., 1981,2,125. -18. Olszowy Z.: Badania doświadczalne nad przebiegiem zatrucia glikolem etylenowym w aspekcie toksykologicznym i medyczno-sądowym. Cz. 1., Arch. Med. Sąd., 2000, L, 1-13. -19. Pach J., Macheta A., Próchnicka B., Białka J., Kreczmar M.: Ostre zatrucia glikolem etylenowym w materiale Kliniki Toksykologii i Zakładu Medycyny Sądowej w Krakowie. Stud. Mat. Monogr. IMP. Łódź, 1983, 2 (15), 123-129. -20. Parry M..F., Wallach R.: Ethylene glycol poisoning. Am. J. Med., 1974, 57, 143-150.

21. Próchnicka B., Kołodziej J., Gierz J.: Śmiertelne zatrucia glikolem etylenowym. Arch. Med. Sąd. Krym., 1979, 29, 313-315. -22. Sharma S., Nath R., Thind S.K.: Recent advances in measurement of oxalate in biological materials. Scanning Microsc., 1993, 7 (1), 431-441. -23. Stokes J.B., Aueron F.: Prevention of organ damage in massive ethylene glycol ingestion. JAMA, 1980, 243, 2065-2070. -24. Tenczyński L.: Przypadek zatrucia glikolem etylenowym. Pol. Tyg. Lek., 1968, 49, 1986-1987.

Adres pierwszego autora:

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej Śląskiej AM

ul. Medyków 18

40-752 Katowice