29Piotr Kozioł, Andrzej Krajka

Analiza statystyczna wyników badań genetycznych przy ustalaniu ojcostwa w przypadku rekonstrukcji fenotypu pozwanego

Genetic data analysis of paternity in cases requiring phenotype reconstruction

Z Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej AM w Lublinie

Kierownik: prof. dr hab. R. Mądro

Z Instytutu Matematyki Uniwersytetu M. Curie-Skłodowskiej w Lublinie

Kierownik: prof. dr hab. Z. Rychlik

W pracy zaproponowano obliczenia biostatystyczne przydatne do oceny wyników badań polimorfizmu DNA wówczas, gdy fenotyp pozwanego o ojcostwo mężczyzny jest rekonstruowany na podstawie wyników badań rodzinnych. W sprawie alimentacyjnej, w której pozwany mężczyzna już nie żył, jego fenotyp ustalono w oparciu o badania żony i trójki dzieci z tego małżeństwa. Następnie przeprowadzono analizę statystyczną hipotezy, że ten sam mężczyzna jest ojcem dziecka powódki oraz dzieci urodzonych w związku małżeńskim. Wyniki oznaczeń 13 układów DNA (4 VNTR i 9 STR) były wystarczające do potwierdzenia tej hipotezy oraz wykazania, że prawdopodobieństwo jego ojcostwa w odniesieniu do dziecka powódki wynosi > 99.9999%.

The paper presents a biostatistical analysis useful for evaluating the results of DNA polymorphism examinations when the defendant's phenotype is reconstructed on the basis of the results of family tests. In the alimony case, in which the defendant was already dead, his phenotype was determined basing on the tests of his wife and their 3 children. Then a hypothesis stating that the same man was the father of the plaintiff's child and the legitimate children was statistically analysed. The findings of the determinations of 13 DNA systems (4 VNTR and 9 STR) were sufficient to confirm this hypothesis and show that his paternity probability regarding the plaintiff's child was >99.9999%.

Słowa kluczowe: obliczenia biostatyczne, dochodzenie ojcostwa, STR, VNTR.

Key words: biostatistical analysis, paternity test, STR, VNTR.

Wstęp

Zastosowanie polimorfizmu DNA w badaniach genetycznych przy ustalaniu pokrewieństwa (dochodzenie ojcostwa, testy imigracyjne) stworzyło bardzo wysoką "szansę wykluczenia" oraz możliwość wypowiadania się w kategoriach uprawdopodobniających ojcostwo, macierzyństwo, pokrewieństwo (4, 7, 9, 11). W sprawach "o ustalanie ojcostwa" ekspertyza DNA odgrywa szczególną rolę z uwagi na fakt, że jest to najbardziej obiektywny dowód, pozwalający sądom na uznanie biologicznego ojcostwa pozwanego lub wykluczenie.

Wartość ekspertyzy DNA zależy od ilości oznaczonych lokus oraz przydatności poszczególnych markerów do badań genetycznych (2, 3, 8). Przy ustalonym zakresie badań uzyskuje się w różnych sprawach różny stopień pewności wnioskowania o ojcostwie pozwanego. Specyfikę polskiego ustawodawstwa rodzinnego, która praktycznie uniemożliwia "pluorum concubinatum" sprawia, że koniecznym jest wykazanie bardzo wysokiego poziomu pewności ojcostwo. Powszechnie uznanym kryterium oceniającym wartość przeprowadzonych badań genetycznych są obliczenia prawdopodobieństwa ojcostwa (1, 2, 5, 14, 15). Zgodnie z ustaleniami Komisji Hemogenetyki Sądowej PTMSiK z 1998 roku do potwierdzenia ojcostwa w oparciu o badania DNA wymaga się obecnie wykazania prawdopodobieństwa ojcostwa > 99,999%.

Gdy znane są fenotypy matki, dziecka i pozwanego, obliczenie prawdopodobieństwa ojcostwa nie nastręcza większych problemów. Natomiast w sytuacji, gdy nie możemy ustalić fenotypu matki (osoba nie żyje lub nie znane jest miejsce jej pobytu) lub gdy z podobnych przyczyn nieznany jest fenotyp pozwanego -ustalamy je w oparciu o badania krewnych, a wykonanie analizy statystycznej komplikuje się. Szczególnie trudna sytuacja powstaje wówczas, gdy zrekonstruowany fenotyp pozwanego zawiera szereg alternatywnych możliwości.

Celem pracy była ocena probabilistyczna wyników badań w sprawie alimentacyjnej w sytuacji, gdy fenotyp pozwanego ustalony został w oparciu o badania jego dzieci urodzonych w związku małżeńskim oraz ich matki.

Materiał i Metody

Zgodnie ze zleceniem Sądu Rejonowego w R. w sprawie alimentacyjnej 1233/99 Zakład Medycyny Sądowej AM w Lublinie wykonał badania genetyczne materiału (krwi), pobranego od : 1/ rodziny pozwanego tj. córki (D1), dwóch synów (D2,D3) oraz żony (Ż) matki dzieci D1, D2 i D3, 2/ powódki (P) i jej dziecka (D4).

Z próbek krwi wyizolowano DNA techniką organiczną a następnie wykonano badania polimorfizmu 4 układów RFLP(VNTR): D4S139, D5S110, D7S21, D11S12 oraz 9 układów STR:

FGA, TPOX, D8S1179, VWA, Penta E, D18S51, D21S11, THO1,D3S1358.

Układy RFLP oznaczano metodą hybrydyzacji fragmentów restrykcyjnych (uzyskanych po trawieniu enzymem Hinf I) z komercyjnymi sondami molekularnymi oraz z użyciem chemiluminescencyjnej techniki detekcji (9, 10). Fenotypowanie wykonano w oparciu o pomiar wielkości fragmentów restrykcyjnych a grupowanie alleli zgodnie z zakresem wielkości (± 2.4% pz) przyjętym w laboratorium genetycznym Zakładu Medycyny Sądowej AM w Lublinie. Częstości alleli ustalane zostały zgodnie z metodą "floating bin" w oparciu o znane fenotypy nie spokrewnionych osób, oznaczane w Zakładzie w latach 1993-1999 (10).

Układy STR oznaczano techniką PCR z użyciem zestawów PowerPlex 2.1 Fluorescent STR firmy Promega. Produkty multipleksowej amplifikacji rozdzielano na żelach denaturujacych PAA, detekcję fragmentów wykonano przy użyciu skanera laserowego FMBIO II firmy Hitaschi. Fenotypy odczytywano porównując fragmenty z drabiną alleli oraz w oparciu o pomiar wielkości w obecności wewnętrznego markera CXR 40-600. Częstości alleli 9 układów STR pochodziły z bazy danych Zakładu Medycyny Sądowej AM w Lublinie, którą ustalono w oparciu o badania 370 nie spokrewnionych osób.

Obliczenia prawdopodobieństwa ojcostwa wykonano w oparciu o wzór Bayes'a przy założeniu "a'priori"=0.5 wg. własnego programu ("Father II" - A.Krajka, P.Kozioł)

Założenia i sposób przeprowadzenia analizy statystycznej alternatywnych hipotez odnośnie ojcostwa pozwanego w stosunku do czwórki badanych dzieci przedstawiono w tej pracy. W dostępnym piśmiennictwie nie znaleziono przykładów statystycznej analizy badań genetycznych w tego typu sprawach.

Wyniki i Dyskusja

Wyniki fenotypowania 4 układów VNTR oraz 9 układów STR żony pozwanego, trójki dzieci z małżeństwa oraz powódki wraz z dzieckiem przedstawiono w tabeli I.

W oparciu o segregację alleli między żoną pozwanego a trójką jej dzieci w obrębie 8 z 13 przebadanych układów (D4S139, D5S110, D7S21, Penta E, D18S51, D21S11, TH01 i D3S1358) ustalono taki zestaw alleli których obecność u mężczyzny pozwalałaby na uznanie go za biologicznego ojca dzieci D1, D2, D3. Natomiast w przypadku układów TPOX, D8S1179 oraz VWA możliwe były dwa alternatywne fenotypy pozwanego, "pasujące" zarówno do dzieci małżeńskich jak i do dziecka powódki. W związku z tym należało założyć, że pozwany posiadał fenotyp homozygotyczny w układzie TPOX (8-8) i D8S1179 (11-11) albo heterozygotyczy TPOX (8-?) i D8S1179 (11-?) co generuje różne wartości prawdopodobieństwa ojcostwa. W tabeli I zaznaczono więc dwie, skrajne jego wartości. W obliczeniach wartości PI pominięto układy D12S11 i FGA. W układzie D12S11 nie ma bowiem wspólnego allelu między dzieckiem powódki i dziećmi z małżeństwa, a w układzie FGA istnieje możliwość wystąpienia u pozwanego dwóch fenotypów (23-25 lub 22-25), przy czym przyjęcie że pozwany miał fenotyp 22-25 prowadzi do wykluczenia ojcostwa lub świadczy o pojawieniu się mutacji. W oparciu o tak zrekonstruowany fenotyp pozwanego dla 11 układów DNA obliczono dwie skrajne wartości PI. Wynosiły odpowiednio 5.7x10⁶ oraz 2.2x10⁷ i w obu przypadkach odpowiadały bardzo wysokiemu prawdopodobieństwu ojcostwa pozwanego (>99.9999%)w stosunku do dziecka (D4) powódki.

Inna możliwość oceny wyników badań genetycznych może polegać na statystycznej analizie alternatywnych hipotez odnośnie ojcostwa mężczyzny (lub mężczyzn) w stosunku do każdego z czworga dzieci. Wymaga to jednak ustalenia czego jesteśmy pewni, a co jest wątpliwe. Ponadto hipotezy muszą być tak skonstruowane by się wzajemnie wykluczały oraz by najbardziej prawdopodobna z nich mogła stanowić rozwiązanie analizowanego problemu. W naszym przykładzie za pewne przyjęliśmy, że matką trójki dzieci małżeńskich D1, D2, D3 jest żona pozwanego Ż, oraz że matką dziecka D4 jest powódka P. Nie istniały bowiem uzasadnione wątpliwości, zobowiązujące nas do stworzenia hipotez weryfikujących również macierzyństwo. 15 przyjętych przez nas hipotez zawiera tabela II. Hipoteza 1 (H₁) zakłada na przykład, że mężczyzna O1 jest ojcem dziecka D1, D2, D3 i D4 natomiast 14 dalszych hipotez przyjmuje, że więcej jak jeden mężczyzna może być ojcem tych dzieci a w skrajnej 15 hipotezie zakładamy, że każde dziecko pochodzi od innego ojca. Każda z postawionych hipotez weryfikowana jest przy tym w stosunku do wszystkich pozostałych.

Tabela II. Hipotezy odnośnie ojcostwa 3 dzieci małżeńskich i dziecka powódki.

Table II. Paternity hypotheses in the cases of 3 legitimate children and the plaintiff's child.

Prawdopodobieństwo hipotezy pierwszej (P[H₁|V]), że pozwany jest ojcem czworga dzieci przy warunku że otrzymano wyniki badań (V)- w naszym przypadku opisanych w tabeli I, zgodnie ze wzorem Bayes'a przyjmuje postać:

gdzie, iloraz największej wiarygodności hipotezy 1 wynosi:

a P[H_i] oznacza prawdopodobieństwo zaistnienia hipotezy H_i, 1Ł iŁ 15, (jest to tak zwane prawdopodobieństwo a'priori), natomiast P[V|H_i] oznacza prawdopodobieństwo otrzymania wyników V przy założeniu słuszności hipotezy H_i, 1Ł iŁ 15.

Zazwyczaj przyjmuje się, że prawdopodobieństwa a'priori są jednakowe. Jednak przy rozważaniu 15 hipotez i obliczaniu P[H₁|V] możemy założyć, że albo wszystkie 15 hipotez jest jednakowo prawdopodobnych albo że hipoteza H₁ i jej zaprzeczenie są jednakowo prawdopodobne (a w obrębie tego zaprzeczenia jednakowo prawdopodobnych jest 14 składowych hipotez). Dalsze obliczenia możemy zatem wykonać w dwóch wersjach A i B.

W wersji (A) przyjmujemy, że hipoteza H₁ i każda ze składowych zaprzeczenia tej hipotezy(H₂....H₁₅) jest jednakowo prawdopodobna, wtedy:

a zaletą tej wersji jest fakt że otrzymane prawdopodobieństwa sumują się do 1 i spełniony jest III postulat Bayes'a, ponadto takie podejście do obliczeń zaleca Hummel (6).

W wersji (B) zakładamy, że przy rozważaniu hipotezy H₁ możemy przyjąć, że jest ona równie prawdopodobna jak wszystkie hipotezy przeciwne razem tzn. prawdopodobieństwo H₁ wynosi 1/2 a prawdopodobieństwo wszystkich hipotez przeciwstawnych H_2È H_3È ...È H₁₅ wynosi również 1/2, wtedy:

W tabeli III przedstawiamy wyniki obliczeń prawdopodobieństwa dla wszystkich postawionych hipotez z uwzględnieniem wersji A i B prawdopodobieństwa a'priori.

Pozostaje do wyjaśnienia w jaki sposób obliczamy wartość P[V|H_i]. Prawdopodobieństwa te oblicza się w zależności od przyjętej hipotezy i wyników badań uzyskanych dla pojedynczego lokus oraz częstości alleli odziedziczonych od ojca. Dla przykładu rozważyć można jak obliczyć te prawdopodobieństwa dla układu D3S1358 przy założeniu hipotezy H₁. Sytuację tę graficznie przedstawia rycina 1.

Tabela III. Prawdopodobieństwa hipotez odnośnie ojcostwa dzieci małżeńskich i dziecka powódki.

Table III. Probabilities of paternity hypotheses in the cases of legitimate children and the plaintiff's child.

Ryc. 1. Schemat dziedziczenia alleli układu D3S1358 w analizowanej sprawie przy założeniu hipotezy H₁ (Symbole i fenotypy jak w tabeli I).

Fig. 1. A diagram of allele inheritance of the D3S1358 system in the analysed case when the H₁ hyphotesis is assumed.(Symbols and phenotypes as in table I).

Przedstawiony schemat dziedziczenia alleli układu D3S1358 przy założeniu hipotezy H₁ stanowi podstawę do obliczenia LR(_Hi,D3S1358) przy czym fenotyp pozwanego nie jest znany, wiemy natomiast, że jedynie mężczyzna o fenotypie 15-18 może być ojcem 4 dzieci. Ze względu na to, że istnieje możliwość mutacji w tym lokus, powinniśmy dodatkowo uwzględnić każdy inny możliwy fenotyp ojca oraz prawdopodobieństwo odziedziczenia allelu przez któreś z dzieci. Dla uproszczenia nasze rozważania przeprowadzimy jednak przy założeniu braku mutacji, chociaż ostateczne wzory użyte w obliczeniach uwzględniają taką możliwość.

Układy dzieci D1, D2, D3 i D4 są zdeterminowane fenotypami rodziców. Przy obliczaniu P[V|H₁] mamy więc do czynienia z trzema losowo spotykającymi się osobami Ż, O, P (o fenotypach 14-17, 15-18 i 14-18) z prawdopodobieństwem v(14,17)v(15,18)v(14,18), gdzie v oznacza częstość fenotypu (f1-f2) oraz z czterema osobami, które otrzymały swoje geny od odpowiednich rodziców z prawdopodobieństwem 1/4 każde. Na tej podstawie otrzymujemy:

Podobnie obliczamy pozostałe prawdopodobieństwa P[V|H_i], 2Ł iŁ 15 w układzie D3S1358 i wstawiliśmy je do wzoru na LR(H_i,D3S1358). Po wykonaniu analogicznych obliczeń z pozostałymi układami DNA uzyskaliśmy (przez przemnożenie poszczególnych wartości LR), ostateczną wartość LR(H₁). Identyczne obliczenia wykonaliśmy dla każdej z hipotez przedstawionych w tabeli II a otrzymane wyniki, które określały ich prawdopodobieństwo przedstawiliśmy w tabeli III z uwzglednieniem wersji (A) i (B) prawdopodobieństwa a'priori.

Istnieje szereg doniesień o celowości badań genetycznych DNA krewnych nie żyjącego rodzica w sprawach sądowych "o ustalania ojcostwa" (3, 12, 13). W oparciu o analizę proporcji wspólnych fragmentów w zakresie polimorfizmu RFLP (oznaczanego przy użyciu sond wielo-lokusowych) można wykazywać pokrewieństwo dziecka powódki z członkami rodziny pozwanego lub jego brak, przy czym założenia matematyczne tych obliczeń są bardzo dyskusyjne (3, 7, 9) Natomiast wyniki badań pojedynczych lokus (VNTR i STR) dostarczają precyzyjnych informacji o tych allelach dziecka które są wspólne z badaną rodziną oraz o ich częstościach w populacji, co może być podstawą do bardziej precyzyjnej oceny prawdopodobieństwa ojcostwa (1, 2, 11, 13).

Rekonstrukcja fenotypu pozwanego w oparciu o badania jego rodziny stwarza jednak nadal szereg problemów. Po pierwsze brak jest ciągłości dowodowej, że allele otrzymane przez dziecko od biologicznego ojca obecne są w fenotypie pozwanego, gdyż taką ciągłość zapewnia jedynie bezpośrednie pobranie materiału biologicznego od pozwanego. Jeżeli pozwany nie żyje i znane jest miejsce jego pochówku, istnieje możliwość uzupełnienia przerwanej ciągłości dowodowej przez pobrania w trakcie ekshumacji fragmentów tkanek ale zdegradowane tkanki nie zawsze nadają się do badań polimorfizmu DNA. Po drugie w tego typu ekspertyzach powstaje pytanie ilu krewnych należy zbadać oraz ile układów należy oznaczyć, aby uzyskać wiarygodny wynik pozwalający na wykluczenie lub potwierdzenie ojcostwa pozwanego. Stosunkowo prosta wydaje się sytuacja jeżeli żyją rodzice pozwanego a wyniki badań genetycznych pobranego od nich materiału wykażą obecność wspólnych alleli u nich i dziecka. Potwierdzenie ojcostwa pozwanego wydaje się wówczas uzasadnione gdy pokrewieństwo między dzieckiem a dziadkami jest wysoce prawdopodobne, pozwany nie miał brata oraz gdy segregacja cech wyklucza ojcostwo dziadka. W podobnych sytuacjach bardziej problematyczne jest opiniowanie wykluczające. Brak wspólnych cech dziecka z dziadkami nie wyklucza bowiem możliwości biologicznego ojcostwa ich syna ze względu na to, że ojcem pozwanego może być inny mężczyzna niż dziadek. Zatem nawet w najprostszych sprawach gdzie fenotyp rodzica jest rekonstruowany, należy uwzględnić różne możliwości dziedziczenia wspólnych alleli.

W omawianym przypadku rekonstrukcję fenotypu pozwanego przeprowadziliśmy na podstawie wyników badań DNA trójki jego dzieci małżeńskich oraz dziecka powódki. Przedstawiliśmy jednocześnie taką analizę statystyczną, która pozwoliła na weryfikację wszystkich możliwych hipotez pochodzenia tych dzieci. W trakcie analizy wykazaliśmy, że hipoteza wg. której "ojcem 3 dzieci małżeńskich oraz dziecka powódki jest ten sam mężczyzna" jest najbardziej prawdopodobna 99,99999% oraz że pozostałe hipotezy są bardzo mało prawdopodobne na podstawie czego mogliśmy wydać opinię pozwalającą na rozstrzygnięcie problemu ojcostwa pozwanego.

Podobną analizę można przeprowadzić w każdym przypadku konieczności rekonstrukcji fenotypu rodzica (zarówno ojca jak i matki) na podstawie wyników badań rodzinnych, a na jej podstawie można dokonać oceny czy przeprowadzone badania są wystarczające do wydawania opinii w kategoriach odpowiadającej pewności. Jeżeli takiej pewności nie osiągniemy należy oznaczyć dodatkowe markery genetyczne zabezpieczonego materiału dowodowego lub wnioskować o konieczności przebadania dalszych członków rodziny.

Piśmiennictwo

1. Berent J.A., Miścicka-Śliwka D.: Algorytm do obliczeń prawdopodobieństwa ojcostwa dla układów dyskretnych i jego praktyczna realizacja. Postępy Med. Sąd. i Krym., 1997, 3, 301-314. -2. Czarny J., Miścicka-Śliwka D., Berent J.A.,Grzybowski T., Wożniak M.: Ocena praktycznej przydatności multipleksowej analizy 12 loci STR zawartych w systemach "GenePrint PowerPlex 1.2 Fluorescent STR System" i "GenePrint FFFL Fluorescent STR System" w dochodzeniu ojcostwa. Arch. Med..Sąd. Krym., 1999, XLIX, 225-231., -3. Czarny M., Kwiatkowska J., Chlebowska H., Siemieniako B., Słomska B., Słomski R.: Skuteczność analizy DNA w dochodzeniu spornego ojcostwa, w przypadkach bliskiego pokrewieństwa rodziców. Arch. Med. Sąd. Krym., 1996, XLVI, 289-297., -4. Czarny M., Kwiatkowska J., Słomska M., SiemieniakoB., Słomski R.: Możliwości badawcze polimorficznych loci DNA człowieka i ich wykorzystanie w badaniach medyczno sądowych. Arch. Med. Sąd. Krym., 1995, XLV, 3-4, 257-269., -5. Henke J., Fimmers R., Baur M.P., Henke L.: DNA-minisatelllite mutations:recent investigations concerning distribution and impact on parentage testing. Int J. Leg. Med. 1993, 105, 217-222., -6. Hummel K.: The Essen-Moller method. Adv.in Forens. Haemogen., 1996, 1, 453-458., -7. Jeffreys A.J., Turner M., Debenham P.: The efficiency of multilocus DNA fingerprint probes for individualisation and establishment of family relationships, determined from extensive casework. Am. J. Hum. Genet., 1991, 48, 824-840., -8. Kozioł P., Ciesielka M.: Ocena przydatnosci badań VNTR lokus D1S80 w sprawach spornego ojcostwa. Arch. Med. Sąd. i Krym., 1994, XLIV, 4459-465., -9. Kozioł P., Tokarzewska J., Krajka A., Mądro R.: Polimorfizm lokus D5S110 w populacji Polski południowo-wschodniej i ocena przydatnosci w ekspertyzie genetycznej ojcostwa. Postępy Med. Sad i Krym 1997, III, 279-287., -10. Kozioł P., Krajka A., Mądro R.: Analiza segregacji fragmentów DNA wielolokusowej sondy MZ1.3 w badaniach genetycznych spornego ojcostwa. Postępy Med. Sad i Krym., 1997, III, 265-277.,

11. Morling N., Hansen H.E.: Paternity testing with VNTR DNA systems. Int. J. Leg. Med. 1993, 105, 189-196., -12. Raczek E., Kabiesz J., Droździok K.: Opiniowanie w oparciu o badania DNA w nietypowych sprawach dochodzenia ojcostwa. Arch. Med. Sąd. Krym., 1997, XLVII, 321-325., -13. Szczotka H., Schlesinger D.: Tablice do obliczania prawdopodobieństwa ojcostwa w populacji polskiej. Materiały i Prace Antropologiczne 1980, 98, 3-51. -14. Słomski R., Dziechciowska K., Lisiecka D., Siemieniako B., Słomska M.: Dochodzenie spornego ojcostwa na podstawie analizy DNA po śmierci ojca lub matki. Arch. Med. Sąd. i Krym., 1997, XLVII, 307-314., -15. Weir B.S.: Genetic Data analysis II. Sinauer Associates, Inc.Publishers.Sunderland 1996

Adres autorów:

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej AM w Lublinie

20-706 Lublin

ul. Jaczewskiego 8