Ryszard Pawłowski, Anita Dettlaff-Kąkol, Grzegorz Jezierski, Agnieszka Maciejewska, Regina Paszkowska, Monika Reichert

Genetyka populacyjna dziewięciu loci typu STR z zestawu Profiler Plus w próbce populacyjnej z obszaru Polski

Population genetics of nine STR loci from the Profiler Plus kit in a population sample from Poland

Z Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej AM w Gdańsku.

p.o. Kierownik: dr hab. Z. Szczerkowska - profesor AM

Praca przedstawia wyniki badań populacyjnych 9 loci typu STR (D3S1358, VWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317 i D7S820) zawartych w komercyjnym zestawie Profiler Plus. Próbki DNA pochodzące od 706 niespokrewnionych osobników poddano amplifikacji metodą multiplex PCR a następnie produkty identyfikowano z zastosowaniem elektroforezy kapilarnej na automatycznym sekwenatorze DNA (ABIPrism 310). W badanej próbce populacyjnej wszystkie badane loci znajdowały się w równowadze opisanej równaniem Hardy'ego- Weinberga. Obliczona wartość prawdopodobieństwa przypadkowej zgodności wynosi 1.25 x 10^-11 dając tym samym średnie prawdopodobieństwo przypadkowej zgodności profili DNA w populacji polskiej wynoszące 1 do 83 miliardów. Zestaw Profiler Plus dzięki bardzo wysokiej sile dyskryminacyjnej jest szczególnie przydatny do badań identyfikacyjnych z zakresu genetyki sądowej.

This paper presents the allele frequency distributions for the nine (D3S1358, VWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317 and D7S820) loci present in the commercially available Profiler Plus kit. DNA samples of 706 individuals from Northern Poland were amplified in a multiplex reaction with subsequent automatic detection using capillary electrophoresis (ABI Prism 310 DNA sequencer). In the analysed population sample all loci met the Hardy-Weinberg equilibrium conditions. The calculated probability of identity is 1.25 x 10^-11 giving on average 1 in 83 billion probability of identity in our population sample. Owing to high discrimination power the Profiler Plus kit is highly useful for forensic identification purposes.

Słowa kluczowe: Multiplex PCR, loci typu STR, genetyka populacyjna, elektroforeza kapilarna, Polska.

Key words: Multiplex PCR, SRT loci, population genetics, capillary electrophoresis, Poland.

Wstęp

Sekwencje typu VNTR-STR są powszechnie stosowane do badań z zakresu genetyki sądowej (2). Opracowanie i zastosowanie techniki multiplex PCR stworzyło możliwość jednoczesnej i szybkiej amplifikacji wielu loci z minimalnej ilości DNA izolowanego np. z plam biologicznych (3,5,6). Połączenie techniki multiplex PCR i fluorescencyjnej detekcji produktów PCR otworzyło nowe możliwości automatycznej analizy wielu polimorficznych loci jednocześnie. Jednym z komercyjnie dostępnych zestawów typu multiplex jest zestaw ProfilerPlus firmy Perkin-Elmer (PE), zawierający 9 loci typu STR (D3S1358, VWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317 i D7S820) i marker płci w postaci locus amelogeniny. Warunkiem wprowadzenia nowego zestawu (lub nowego locus) do praktyki genetyki sądowej jest nie tylko poznanie wpływu różnorodnych czynników na czułość, wiarygodność i powtarzalność analizy (12), ale również poznanie częstości alleli obecnych w analizowanych loci. Głównym celem niniejszej pracy było zbadanie rozkładu częstości alleli dziewięciu loci typu STR zawartych w zestawie Profiler Plus w próbce populacyjnej liczącej 706 osobników pochodzących z obszaru Polski oraz porównanie ich rozkładu z zaobserwowanymi w dwóch innych populacjach europejskich oraz populacji Polski północnej.

Materiały i metody

Materiał do badań populacyjnych stanowiły próbki krwi lub wymazy z jamy ustnej pobierane jako materiał porównawczy do badań identyfikacyjnych śladów biologicznych pochodzące od osób z różnych regionów Polski. Na materiał ten złożyły się próbki niespokrewnionych 166 kobiet i 540 mężczyzn. Ekstrakcję DNA przeprowadzano metodą opisaną wcześniej (13) lub metodą z Chelex-100 (17). Ilość DNA oznaczano metodą hybrydyzacji z sondą swoistą dla DNA naczelnych (QuantiBlot, PE, USA) z chemiluminescencyjną metodą detekcji lub pomiarem fluorymetrycznym.

Amplifikację loci zawartych w zestawie ProfilerPlus prowadzono w warunkach opisanych przez producenta stosując termocykler 2400 lub robot do reakcji PCR 877 firmy PE. Warunki przygotowania próbek do elektroforezy kapilarnej i sam ich rozdział prowadzono w warunkach jak opisano uprzednio (10,11). Jako standardu wewnętrznego wielkości DNA używano GS500, znakowanego ROX (PE) lub ILS600 znakowanego CXR (Promega).

Sekwencjonowanie produktów PCR (allel 16 FGA i allel 33.1 locus D21S11) przeprowadzano z zastosowaniem odpowiednich starterów (1,14). Matryce do reakcji sekwencjonowania przygotowywano wg. metody opisanej przez Walsha i wsp. (16). Reakcje sekwencjonowania prowadzono z zastosowaniem zestawu firmy PE (BigDye Terminator sequencing kit) w warunkach opisanych wcześniej (17).

Analiza statystyczna. Weryfikację zgodności z równaniem Hardy'ego-Weinberga prowadzono testami exact i LR (7,18). Obserwowaną heterozygotyczność (H), siłę dyskryminacji (PD), średnią szansę wykluczenia (MEC) i zawartość informacji polimorficznej (PIC) obliczano jak uprzednio (10).

Wyniki i dyskusja

Łącznie przy zastosowaniu zestawu Profiler Plus amplifikacji poddano 1048 próbek DNA pochodzących z materiału porównawczego. Z tej ilości, po odrzuceniu próbek pochodzących od osób spokrewnionych, analizie statystycznej poddano 706 profili DNA. Ze wszystkich przebadanych próbek, w zaledwie kilku przypadkach, konieczne było powtórne zamplifikowanie lub nastrzyknięcie produktów na kapilarę. Zaobserwowano, że dla trzech loci znakowanych NED (D5S818, D13S317 i D7S820) uzyskuje się najniższy sygnał amplifikacyjny w porównaniu do pozostałych znakowanych JOE i 5-FAM. Najwyższe sygnały amplifikacyjne obserwowano dla loci D3S1358, VWA i FGA znakowanych 5-FAM. Zaobserwowana sytuacja nie przynosi problemów interpretacyjnych w przypadku badania materiału porównawczego, jednak podczas analizy zdegradowanego materiału biologicznego, czy próbek będących mieszaninami DNA często dochodzi do utraty sygnałów amplifikacyjnych dla "żółtych loci" stwarzając tym samym trudności natury interpretacyjnej.

Tabela 1 przedstawia zaobserwowane częstości alleli dla 9 loci zawartych w zestawie Profiler Plus w populacji polskiej zaobserwowane w próbce populacyjnej 706 niespokrewnionych osób obu płci z obszaru Polski. Dla poszczególnych loci stwierdzono od 8 (D13S317) do 17 (FGA) alleli. Jednocześnie zidentyfikowano trzy rzadkie allele FGA*16, D21S11*33.1 oraz D3S1158*20. Obecność dwóch pierwszych potwierdzono sekwencjonowaniem, w przypadku trzeciego (D3S1158) wykrytego niedawno, nie potwierdzono jeszcze sekwencjonowaniem jego pewnej obecności. Allel ten wykazuje jednak dokładnie o 4pz większą długość niż allel 19 obecny w drabinie alleli tego locus. W wyniku sekwencjonowania 16 allela FGA stwierdzono następującą sekwencję w rejonie repetytywnym: (TTTC)₃ TTTT TTCT (CTTT)₈ CTCC (TTCC)₂, co odpowiada dokładnie sekwencji 16 allela wg. nomenklatury i danych przytoczonych przez Barbera i wsp. (1). W przypadku allela 33.1 z locus D21S11 (nie opisanego dotychczas w publikacjach) stwierdzono następującą sekwencję obszaru repetytywnego: FR- (TCTA)₅ (TCTG)₆ - CR - (TCTA)₁₃ -A-TCTA-FR, gdzie FR oznacza obszar flankujący, a CR obszar stały o długości 43 nukleotydów i sekwencji (TCTA)₃TA(TCTA)₃TCA(TCTA)₂TCCATA. Allel ten zgodnie z nomenklaturą International Society of Forensic Genetics nazwano 33.1.

W wyniku zastosowania odpowiednich testów (7, 18), stwierdzono że wszystkie badane loci znajdują się w równowadze opisanej równaniem Hardy'ego-Weinberga (tabela I). Najbardziej polimorficzne podobnie jak dla próbki 202 osób z populacji Polski północnej (12), okazały się loci: D18S51, HUMFGA i D21S11, a najmniej D5S818. Podobne wyniki uzyskano podczas badań populacji austriackiej i hiszpańskiej (4).

Tabela I. Częstości alleli i współczynniki statystyczne charakteryzujące loci ProfilerPlus w populacji polskiej (n=706).

Table I. Allele frequencies and some statistical indices for Profiler Plus loci in a polish population (n=706).

Porównując wyniki analiz statystycznych dla obu próbek populacyjnych 202 osób z obszaru Polski północnej i 706 osobników z obszaru całej Polski można stwierdzić, że są one zbliżone. Największy wpływ powiększenia próbki populacyjnej zaobserwowano dla locus D13S317, gdzie stwierdzono największy wzrost wartości PD, PIC i MEC. Powiększenie próbki populacyjnej spowodowało też, zgodnie z oczekiwaniami wzrost ilości obserwowanych alleli. Łączna ilość zaobserwowana dla populacji 202 osób wyniosła 91, a dla 706 osób - 105. Uzyskane częstości alleli są zbliżone do tych, które zaobserwowano dla próbki populacyjnej z obszaru Polski północnej (12). Wyniki te świadczą o dużej homogenności rozkładu alleli dla badanych loci w populacji polskiej.

Obliczone prawdopodobieństwo przypadkowej zgodności profili DNA dla populacji 706 osób (1.26 x 10^-11) jest wyraźnie wyższe niż dla 202 osób (2.26 x 10^-11). Oznacza to średnie prawdopodobieństwo identyczności wynoszące odpowiednio 1 na 83 miliardy i 1 na 44 miliardy osób. Jest to wartość zbliżona do tych, które uzyskano dla próbek populacyjnych w Austrii i Hiszpanii wynoszące odpowiednio 1 na 96 i 109 miliardów osób (4,9).

Tabela II przedstawia porównanie homogenności rozkładu alleli loci Profiler Plus pomiędzy populacją polską, a austriacką i hiszpańską. Porównanie homogenności rozkładu częstości alleli pomiędzy populacją polską a austriacką wykazało istotne statystycznie różnice dla loci: FGA, D18S51 i D13S317, natomiast porównanie z populacją z południowej Hiszpanii wykazało brak istotnych różnic tylko dla 2 loci (D7S820 i VWA).

Otrzymane współczynniki statystyczne charakteryzujące poszczególne loci zawarte w zestawie ProfilerPlus oraz ich łączna wartość świadczy o jego wysokiej przydatność do badań identyfikacyjnych w genetyce sądowej.

Tabela II. Porównanie homogenności rozkładu alleli loci ProfilerPlus pomiędzy populacjami polską, austriacką i hiszpańską.

Table II. Comparison of homogeneity distribution of Profiler Plus alleles between polish Austrian and Spanisch populations.

PiŚmiennictwo

1. Barber M.D., McKeown B.J., Parkin B.H.: Structural variation in the alleles of a short tandem repeat system at the human alpha fibrinogen locus. Int J Leg Med. 1996, 108, 180-185 - 2. Brinkmann B.: The STR approach. Adv Forensic Haemogenetics, 1996, 6, 41-51. - 3. Budowle B., Smerick J.B., Keys K.M., Moretti T.R., United States population data on the multiplex short tandem repeat loci - HUMTH01, TPOX, and CSF1PO - and the variable number tandem repeat locus D1S80. J Forensic Sci 1997, 42, 846-849. - 4. Entrala C., Lorente M., Lorente J.A., Alvares J.C., Moretti T., Budowle B. Villanueva E.: Fluorescent multiplex analysis of nine STR loci: Spanish population data. Forensic Sci Int 1998, 98, 179-183. - 5. Furedi S., Budowle B., Woller J., Padar Z.: Hungarian population data on six STR loci - HUMVWFA31, HUMTH01, HUMCSF1PO, HUMFES/FPS, HUMTPOX, and HUMHPRTB -derived using multiplex PCR amplification and manual typing. Int J Leg Med 1996, 109, 100-101. - 6. Greenhalgh M.J.: Casework experiences with a multiplex STR system. Adv. Forensic Haemogenetics 1996, 6, 249-251. - 7. Guo S.W, Thompson E.A.: Performing the exact test of Hardy-Weinberg proportion for multiple alleles. Biometrics 1992, 48, 361-372. - 8. Mills K.A., Even D., Murray J.C.: Tetranucleotide repeat polymorphism at the human alpha fibrinogene locus (FGA). Hum Mol Genet 1992, 1, 79-82. - 9. Nuehuber F., Radacher M., Meisner N., Tutsch-Bauer E.: Nine STR markers plus amelogenin (AmpFlSTR Profiler Plus): a forensic study in an Austrian population. Int J Legal Med 1999, 113, 60-62. - 10. Pawłowski R.: HUMFIBRA allele distribution in Northern Poland using capillary electrophoresis. Int J Legal Med 1999, 112, 139-141.

11. Pawłowski R., Branicki W., Kupiec T.: Y-chromosomal polymorphic loci DYS19, DYS390, DYS393 in a population sample from northern Poland. Electrophoresis 1999, 20, 1702-1706. - 12. Pawłowski R., Maciejewska A.: The forensic validation of multiplex containing nine STRs - population genetics in Nothern Poland. Int J Legal Med 2000 (w druku) - 13. Pawłowski R., Maciejewska A., Paszkowska R., Welz A.: Frequencies of the five short tandem repeat systems (STR) in a population from North Poland. Int J Legal Med 1997, 110, 10-13. - 14. Sharma V., Litt M.: Tetranucleotide repeat polymorphism at the D21S11 locus. Hum Mol Genet 1992, 1(1), 67. - 15. Wallin J.M., Buoncristiani M.R., Lazaruk K.D., Fildes N., Holt C.L., Walsh P.S.: TWGDAM validation of the AmpFISTR blue PCR amplification kit for forensic casework analysis. J Forensic Sci. 1998, 43, 854-870. - 16. Walsh P.S., Fildes N.J., Reynolds R.: Sequence analysis and characterization of stutter products at the tetranucleotide repeat locus vWA. Nucleic Acids Res 1996, 24, 2807-2812. - 17. Walsh P.S., Metzger D.A., Higuchi R.: Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques. 1991, 10(4), 506-13. - 18. Weir B.S.: Independence of VNTR alleles defined by fixed bins. Genetics 1992, 130, 873-878.

Adres pierwszego autora:

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

80-210 Gdańsk

ul. Curie Skłodowskiej 3A