Zofia Szczerkowska, Inga Antyborzec

System Silver STR™ Multiplex - zastosowanie w medycynie sądowej

Silver STR™ Multiplex System - application in forensic medicine

Z Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej AM w Gdańsku

p.o. Kierownik: dr hab. Z. Szczerkowska - profesor AM

Fenotypy i allele trzech wysoce polimorficznych systemów STR D13S317, D7S820 i D16S539 oznaczono w DNA wyizolowanym z krwi płynnej, plam krwi i mięśni. Amplifikację prowadzono przy użyciu komercyjnego zestawu Silver STR™ Multiplex (Promega). W analizowanych systemach wykazano 24 różne allele. Nie stwierdzono odchyleń od prawa Hardy-Weinberg. Obliczone parametry statystyczne PD, PIC, MEC, MEP, PE, PI oraz HE wskazują na wysoką przydatność trzech analizowanych systemów w medycynie sądowej.

Phenotypes and alleles of three high polymorphic systems STR: D13S317, D7S820 and D16S539 were determined in DNA isolated from blood samples (194-220 unrelated individuals of both sexes), blood stains and muscles. Amplification was performed using the commercially available Gene Print Silver STR™ III Multiplex System (Promega) kit. A total of 24 alleles for all systems could be observed. Distribution of alleles frequencies indicated no deviation from the Hardy-Weinberg equilibrium. Statistical parameters: PD, PIC, MEC, MEP, PE, PI and heterozygosity has shown the usefulness of the D13S317, D7S820 and D16S539 in forensic practice.

Słowa kluczowe: PCR, STR, analiza populacyjna, multiplex.

Key words: PCR, STR, multiplex analysis, population study.

Określanie profili genetycznych polimorficznych sekwencji DNA stanowi rutynową metodę badawczą w wielu dyscyplinach medycznych. Badania te mają szczególne znaczenie w praktyce sądowo-lekarskiej zarówno w identyfikacji śladów biologicznych jak i w dochodzeniu ojcostwa. Powszechnie stosowane analizy dotyczą krótkich mikrosatelitarnych sekwencji DNA - STR. Metodą PCR można określić allele pojedynczych loci genowych, a stosując zestawy typu multiplex PCR w czasie jednej reakcji możliwe jest równoczesne zamplifikowa-nie alleli większej ilości polimorficznych systemów. Warunkiem powodzenia tego typu reakcji jest zbliżona do siebie temperatura hybrydyzacji primerów, a także wybór takich loci, które mają różny zakres wielkości alleli.
W pracy przedstawiono wyniki badań z zastosowaniem komercyjnego zestawu Silver STR™ Multiplex f-my Promega umożliwiającego równoczesną amplifikację alleli trzech miejsc genowych: D13S317, D7S820 i D16S529 z repetytywną czteronukleotydową sekwencją AGAT. Locus D13S317 mieści się na chromosomie 13q 22 - q31 i obejmuje 165-197 pz, locus D7S820 mieści się na chromosomie 7q 11.21 - q22 i zawiera 215 - 247 pz, a D16S539 z zakresem długości 264-304 pz na chromosomie 16q 24qter. W systemie D13S517 i D7S820 opisano po 11 różnych alleli, 9 różnych alleli w systemie D16S539.

MATERIAŁ I METODY

Polimorfizm trzech STR loci D13S317, D7S820 i D16S539 oznaczono w DNA wyizolowanym z 194-220 próbek krwi płynnej dorosłych niespokrewnionych osób z terenu Polski północnej, a także w DNA wyizolowanym z plam krwi (na bibule lub płótnie) oraz z tkanek mięśniowych (mięśnie poprzecznie prążkowane).
Do izolacji DNA w zależności od rodzaju materiału biologicznego stosowano różne metody. W przypadku krwi płynnej metodę nieenzymatyczną (6), do izolacji DNA z plam krwi stosowano Chelex (7) a także zestaw f-my Promega lub f-my A & A Biotechnology, DNA z mięśni izolowano klasyczną metodą fenolowo-chloroformową (8). Jakość i ilość DNA oceniano spektrofotometrycz-nie.
Amplifikacja alleli
Do amplifikacji alleli trzech analizowanych loci użyto zestawu Silver STR™ Multiplex. Reakcję prowadzono w termocyclerze Mastercycler Grandient (Zeiss). W celu zoptymalizowania warunków reakcji PCR oceniono wpływ stężenia matrycowego DNA, Taq polimerazy i primerów, a także temperatury hybrydyzacji primerów, dokonano również ustaleń metodycznych odnośnie warunków elektroforezy i detekcji alleli.
Przyjęto, że najbardziej optymalnym stężeniem matrycowego DNA jest 0,2-0,5 ng/ľl. Mając na uwadze swoistość amplifikacji jako najbardziej korzystną temperaturę hybrydyzacji przyjęto 60°C, a oceniając możliwość prawidłowej amplifikacji przy różnych rozcieńczeniach mieszaniny primerów zawartych w zestawie przyjęto, że korzystny rezultat można uzyskać rozcieńczeniu 1:4. Badając wpływ stężenia polimerazy Taq na efektywność amplifikacji stosowano różne stężenia enzymu od 0,06 - 0,5 u/ľl mieszaniny. Jako najbardziej optymalne przyjęto stężenie 0,35 u/ľl. Amplifikację próbek a całkowitej objętości 12,5 ľl prowadzono w 30 cyklach w następujących warunkach.
Inkubacja wstępna 96°C/2 min.

10 cykli:
denaturacja 94°C/1 min.
hybrydyzacja 60°C/1min.
elongacja 70°C/1,5 min.

20 cykli:
denaturacja 90°C/1 min.
hybrydyzacja 60°C/1min.
elongacja 70°C/1,5 min.

Wydłużenie końcowe 60°C/60 min.

Produkty PCR rozdzielano na komercyjnych żelach poliakrylamidowych (f-my Amresco) lub na żelach sporządzanych we własnym zakresie (19.33 ml H2O, 16,8 g mocznika, 2 ml 10 x TBE, 6 ml bis-akrylamidu). Najlepsze wyniki uzyskano przy stosowaniu żeli 6%, ważna przy tym była wysoka jakość stosowanych odczynników. Elektroforezę prowadzono w następujących warunkach:

	pre elektroforeza	właściwa elektroforeza
natężenie (mA)	28	28
moc (W)	40	40
napięcie (V)	1300	1370
temperatura (˚C)	40-50	50
czas	45 min	2,5 godz.

Do detekcji alleli zastosowano zmodyfikowaną metodę Allelna (1). Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej.

WYNIKI I OMÓWIENIE

Zastosowana w pracy metoda badawcza pozwoliła na wykazanie fenotypów analizowanych loci genowych: D13S317, D7S820 i D16539 we wszystkich próbkach DNA wyizolowanego zarówno z krwi płynnej jak i z plam krwi oraz mięśni. Należało przy tym zwrócić uwagę na to aby zawartość matrycowego DNA nie była wyższa niż 2-2,5 ng, gdyż w przeciwnym przypadku obserwowa-no artefakty charakterystyczne dla STR loci (sutter bands). Ważnym było również przestrzeganie ustalonego reżimu metodycznego zarówno w odniesie-niu do amplifikacji jak i warunków elektroforezy i detekcji alleli. W badanej populacji wykryto 25 fenotypów w locus D13S317, 27 fenotypów w locus D7S820 i 20 w locus D16S539. Rozkład fenotypów analizowanych loci przedsta-wiono w tabeli I.

Tabela I. Częstości fenotypowe D13S317, D7S820 i D16S539 w populacji Polski
północnej.
Table I. Phenotype frequency distribution for systems: D13S317, D7S820 and
D16S539 in the Northern Poland population.

Fenotyp

Phenotype

D13S317

D7S820

D16S539

n = 220

Częstości obserwo-wane

Observed frequency

Częstości oczeki-wane

Expected frequency

n = 197

Częstości obserwowane

Observed frequency

Częstości oczekiwane

Expected frequency

n = 194

Częstości obserwowane

Observed frequency

Częstości oczekiwane

Expected frequency

7/8

7/9

7/10

7/11

8/8

8/9

8/10

8/11

8/12

8/13

8/14

9/9

9/10

9/11

9/12

9/13

9/14

10/10

10/11

10/12

10/13

10/14

11/11

11/12

11/13

11/14

11/15

12/12

12/13

12/14

13/13

13/14

13/15

0,0182

0,0227

0,0273

0,0909

0,0636

0,0273

0,0136

0,0091

0,0591

0,0273

0,0136

0,0409

0,0227

0,0182

0,1409

0,1454

0,0545

0,0409

0,0045

0,0818

0,0318

0,0136

0,0045

4,3738

4,5289

22,2724

14,5173

4,653

2,6677

2,3448

11,53

7,5161

2,4090

1,3812

1,1724

11,5311

7,5161

2,4090

28,3538

36,9626

11,847

6,7923

0,3159

12,0463

7,7220

4,4273

1,4190

0,0051

0,0101

0,0152

0,0508

0,0812

0,0355

0,0406

0,0254

0,0609

0,0508

0,0609

0,0152

0,0051

0,0914

0,1167

0,0711

0,0203

0,0051

0,0660

0,0914

0,0101

0,0203

0,0101

0,0051

0,6915

0,7683

1,03932

1,1422

3,590

7,9785

14,4676

11,8614

8,3508

2,2870

4,4325

16,0752

13,1793

9,2787

2,8380

0,4728

14,5748

23,8900

16,8254

5,1463

0,8573

9,7966

13,7943

3,7781

4,8558

2,6598

0,1355

0,0103

0,0206

0,0773

0,0258

0,0051

0,0036

0,0258

0,0361

0,0825

0,1753

0,1289

0,0155

0,0927

0,1340

0,0257

0,0051

1,1795

0,838

1,7626

9,0823

8,5445

6,4532

1,3145

6,9591

6,5471

4,9446

17,9287

33,7342

25,4776

5,1898

15,8684

23,9690

4,8825

9,0512

0,2514

W locus D13S317 najczęstszym był fenotyp 11/11 i 11/12, w D7S820 10/11, a w locus D16S539 11/12 i11/13.
W oparciu o uzyskane częstości fenotypowe obliczono częstości alleli, przedstawiono je w tabeli II.

Tabela II. Częstość alleli w systemie Silver STR™ III Multiplex w populacji
Polski północnej.
Table II. Allele frequency distribution for Silver STR™ Multiplex in the Northern
Poland population.

Allele

D13S317

D7S820

D16S539

14,1%

7,3%

35,9%

23,4%

7,5%

4,3%

0,2%

1,3%

13,5%

15,0%

27,2%

22,3%

15,7%

4,3%

0,8%

1,0%

7,7%

5,9%

30,4%

28,6%

21,6%

4,4%

0,3%

Łącznie Total

1,000

Najczęstszymi allelami w locus D13S317 są 11 i 12, w locus D7S820 10 i11, a w D16S539 11, 12 i 13. W celu sprawdzenia czy badana populacja pozostaje w równowadze Hardy-Weinberga obliczono częstości oczekiwane, a uzyskane wartości zweryfikowano testem c2. Dla locus D13S317 c2 = 20,36, dla D7S820 c2 = 24,22, a dla D16S539 c2 = 28,89, przy 28 st. swobody p>0,001. Analizowa-na populacja odpowiada więc warunkom próby losowej. Dla oceny prawidłowo-ści interpretacji wyników obliczono heterozygotyczność. Dla układu D13S317 wynosi ona 0,7455, dla D7S820 - 0,7817, a dla D16S539 - 0,7990, hetero-zygtyczność oczekiwana wynosi odpowiednio 0,7601, 0,8111 i 0,7693. Uzyskana zgodność dowodzi prawidłowości stosowanych metod.
Rozkład częstości alleli w populacji polskiej porównano z danymi innych autorów (tabela III).

Tabela III. Częstości alleli w systemach: D13S317, D7S820 i D16S539.
Table III. Allele frequency in systems: D13S317, D7S820 and D16S539.

locus D13S317

Allele

Polska

n=220

Hiszpania

n=212

(4)

Włochy

n=446

(5)

Tajlandia

n=146

(3)

USA (2)

europejska

n=285

azjatycka

n=195

0,141

0,073

0,359

0,234

0,075

0,002

0172

0,066

0,271

0,259

0,115

0,049

0,128

0,083

0,054

0,291

0,318

0,090

0,031

0,004

0,003

0,319

0,113

0,185

0,223

0,116

0,024

0,007

0,099

0,076

0,051

0,318

0,308

0,112

0,036

0,003

0,323

0,146

0,110

0,223

0,146

0,038

0,010

locus D7S820

Allele

Polska

n=197

Hiszpania

n=212

(4)

Włochy

n=446

(5)

Tajlandia

n=146

(3)

USA (2)

europejska

n=285

azjatycka

n=195

0,013

0,135

0,150

0,272

0,223

0,157

0,043

0,008

0,028

0,151

0,139

0,314

0,188

0,155

0,021

0,002

0,025

0,193

0,087

0,274

0,249

0,141

0,025

0,007

0,175

0,051

0,182

0,353

0,195

0,027

0,010

0,017

0,016

0,014

0,281

0,202

0,140

0,029

0,007

0,008

0,113

0,074

0,005

0,164

0,377

0,221

0,036

0,003

locus D16S539

Allele

Polska

n=194

Hiszpania

n=212

(4)

Włochy

n=446

(5)

USA (2)

europejska

n=285

azjatycka

n=195

0,010

0,077

0,059

0,304

0,286

0,216

0,044

0,003

0,009

0,120

0,061

0,264

0,299

0,224

0,018

0,002

0,029

0,119

0,054

0287

0,298

0,186

0,027

0,002

0,105

0,067

0,272

0,339

0,163

0,033

0,002

0,008

0,274

0,108

0274

0,228

0,095

0,027

Przedstawione w pracy częstości trzech analizowanych loci są zbliżone do częstości obserwowanych w innych populacjach europejskich, znaczące różnice zaobserwowano przy porównaniu własnych wyników z danymi dotyczącymi populacji azjatyckich.
W oparciu o wyniki badań populacyjnych obliczono niektóre z parametrów statystycznych charakteryzujących przydatność systemu Silver STR™ Multiplex w medycynie sądowej. Przedstawiono je w tabeli IV.

Tabela IV. Parametry charakteryzujące przydatność systemu Silver STR™
w medycynie sądowej.
Table IV. Statistical parameters indicate usefulness of the Silver STR™
Systems in forensic medicine.

Locus	Siła dyskryminacji Power of discrimination	Zawartość informacji genetycznej Polymorphism information content	Szansa wykluczenia ojcostwa Mean exclusion chance	Prawdopodobieństwo wykluczenia ojcostwa Mean exclusion probability	Siła wykluczenia ojcostwa Power of exclusion	Wskaźnik ojcostwa Paternity index
D13S3317	0,92417	0,74930	0,58363	0,56264	0,502	1,96
D7S820	0,93514	0,78189	0,62144	0,61972	0,566	1,29
D16S539	0,90477	0,73061	0,55227	0,54328	0,597	2,49

Powyższe parametry wskazują na przydatność analizowanych loci w medy-cynie sądowej. Wysoka siła dyskryminacji oraz korzystny współczynnik zawartości informacji genetycznej znajdują zastosowanie w badaniach identyfikacyjnych, a obliczona w oparciu o przeprowadzone badania szansa wykluczenia ojcostwa stawia ten układ w rzędzie korzystnych markerów genetycznych w sprawach o ustalenie ojcostwa.

WNIOSKI

Zastosowana w pracy metoda pozwala na prawidłowe i jednoznaczne określenie alleli trzech loci genowych: D13S317, D7S820 i D16S539.
Przeprowadzenie jednoczesnej amplifikacji alleli trzech loci w czasie jednej reakcji multiplex pozwala na obniżenie kosztów badania, zmniejszając przy tym ryzyko kontaminacji z obcym DNA.
Metodę charakteryzuje wysoka czułość. Do badań wystarczy niewielka ilość matrycowego DNA wyizolowanego z krwi płynnej, ze śladów krwi, lub innych tkanek (mięśni).
Analizowane loci genowe są wysoce polimorficzne, a obliczona parametry statystyczne wskazują na ich wysoką przydatność w medycynie sądowej.

PIŚMIENNICTWO

1. Allen R., Grawes G., Budowle B. Polymerase chain reaction amplification products separated on rehydratable gels and stained with silver. Biotechniques 1989, 7, 736. -2. Budowle B., Moretti TR., Baumstark AL., Defenbaugh DA., Keys KM.. Population data on the thirteen CODIS core short tandem repeat loci in Afican Caucasians, Hispanics, Bahamians, Jamaicans, and Trinidadians. J. Forensic Sci, 1999 6, 1277-86 -3. Chang-En Pu, Ching-Mei Hsieh, Meng-Yi Chen, Fang-Chin Wu, Chien-Feng Sun. Genetic variation at nine STR loci in populations from the Philippines and Thailand living in Taiwan. Forensic Science International 1999, 106, 1-6. -4. Entrala C., Lorente J., Lorente M., Alvarez J., Budowle B., and Villanueva E. Population Studies and Casework Application with the New GenePrint™ Silver STR III Multiplex (D16S539, D7S820, D13S317). J. Forensic Sci. 1999 5, 1032-4. -5. Garofano L., Pizzamiglio M., Vecchio C., Lago G., Floris T., D'Errico G., Brembilla G., Romano A., Budowle B. Italian population data on thirteen short tandem repeat loci: HUMTH01, D21S11, D18S51, HUMVWFA31, HUMFIBRA, D8S1179, HUMTPOX, HUMCSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, D3S1358, Forensic Sci. Int. 1998, 97, 53-60. -6. Lahiri D.K., Bye S., Nurnberger J.L. Hodes M.E., Crisp M., A non-organic and non-enzymatic extraction method gives higher yields of genomic DNA from whole-blood samples than do nine other methods tested. Journal of Biochemical and Biophysical Methods 1992, 25, 193-205. -7. Walsh P.S., Metzer D.A. and Higuchi R. ChelexR100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques 1991, 10, 506-513. -8. Wiegand P., Schurenkamp M., Schuttle U. DNA extraction from mixtures of body fluid using mild preferential lysis. Int. J. Leg. Medicine 1992, 104, 359-360.

Adres pierwszego autora:
Katedra i Zakład Medycyny Sądowej
80-210 Gdańsk
ul. Curie Skłodowskiej 3A