Elżbieta Bloch-Bogusławska

Wpływ czasu zgonu, jonów Ca i NO na reaktywność tętnic ogonowych szczura wyzwalaną przez AVP

The influence of the time of death, Ca ions and NO on the reactivity of a rat's caudal artery regulated by arginine-vasopressin

Z Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej AM w Bydgoszczy

Kierownik: prof. dr hab. K. Śliwka

Badania na perfundowanych arginin⁸-wazopresyną (AVP) tętnicach ogonowych szczura prowadzono w 4 grupach czasowych, w oparciu o dwa niezależne modele doświadczalne: I - z wykorzystaniem tylko wewnątrzkomórkowej puli jonów wapnia (Ca²⁺) i model II z wykorzystaniem tylko puli zewnątrzkomórkowej jonów Ca. Stosując inhibitor syntazy tlenku azotu (NOS) wykazano znaczącą rolę NO na rozkurcz pośmiertny tętnicy. Badania wykazały, że w miarę upływu czasu od zgonu najprawdopodobniej dochodzi do obniżenia stężenia wewnątrzkomórkowych jonów Ca oraz hamowane są procesy napływu jonów Ca z przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Zastosowanie inhibitora NOS wpływa na poprawę reaktywności tętnicy w warunkach napływu jonów Ca z puli zewnątrzkomórkowej.

The contraction of arteries is influenced by many factors. The aim of this research was to analyze how an artery's reactivity, regulated by arginine-vasopressin changes in time, from the moment of death onwards. The research was conducted on rats' perfundated caudal arteries in four different time groups, with reference to two independent empirical models: I - with the sole use of intracellular Ca ions; and model II - with the sole use of extracellular Ca ions. The influence of NO on the arteries was analyzed in the two models, with the use of the NOS inhibitor. The research had shown that with the passing of time, begining from the moment of death onwards, the process of emission of intracellular Ca ions and the infusion/transport of Ca ions from extracellular areas/spaces is inhibited. The use of the NOS inhibitor increases the artery's reactivity provided that the infusion of Ca ions from extracellular areas is also prevalent.

Słowa kluczowe: czas zgonu, Ca²⁺, NO, arginino-wazopresyna

Key words: time of death, Ca^2+, NO, arginine-vasopressin

I. WSTĘP

Śmierć to nieodwracalne ustanie czynności życiowych organizmu. Z uwagi na fakt, że na poziomie komórkowym nie jest to proces jednoczasowy, zgromadzone zasoby tlenu i związków wysoko energetycznych można wykorzystywać do badań nad reakcjami interletalnymi i ustaleniem czasu zgonu. Wykazano (23, 24, 25), że reaktywność tętnicy na fenylefrynę i noradrenalinę (31) obniża się w miarę upływu czasu po zgonie, co wiązano ze zmniejszeniem puli receptorów rezerwowych, nie stwierdzono natomiast zależności od przyczyny zgonu.

Receptory wazopresynowe AVP-V₁ występujące w naczyniach krwionośnych pośredniczą w wyzwalaniu aktywności naczyniozwężającej. Receptor ten zaliczany jest do grupy receptorów metabotropowych (3). Po związaniu ligandu aktywny receptor aktywuje białko G a poprzez białko G fosfolipazę C (PLC), znajdującą się po wewnętrznej stronie błony komórkowej. PLC z kolei katalizuje hydrolizę 4,5-difosforanu fosfatydyloinozytolu (PIP₂) do inozynotrifosforanu - (IP₃) i diacylogicerolu (DAG). IP₃ dyfunduje do siateczki endoplazmatycznej, gdzie powoduje uwalnianie jonów Ca do cytoplazmy (4).

Receptory sprzężone z białkami G kontrolują nie tylko aktywność PLC ale również fosfolipazy A (PLA), cyklazy adenylanowej i fosfodiesterazy cGMP oraz kanały jonowe (5).

Stężenie jonów Ca pełni ważną rolę w wyzwalaniu skurczu komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Wzrost stężenia jonów wapnia w cytoplazmie wynika z napływu jonów Ca przez sarkolemę i/lub ich uwalniania z zapasów wewnątrzkomórkowych (1, 7, 16).

W regulowaniu czynności mięśni gładkich naczyń ważną rolę pełni śródbłonek. Komórki śródbłonka naczyniowego uwalniają różne substancje wazoaktywne w tym prostacyklinę (PG), tlenek azotu (NO) i endotelinę (8, 12, 13, 14).

NO powstaje z L-argininy przy udziale syntazy tlenku azotu (NOS) (29) wówczas, gdy w komórkach śródbłonka wzrasta stężenie jonów Ca. NO powoduje rozkurcz mięśni gładkich w wyniku zwiększenia syntezy cGMP (16, 22).

W badaniach farmakologicznych nad układem naczyniowym odkryto, że tlenek azotu jest głównym, aktywnym biologicznie składnikiem endotelialnego czynnika rozkurczowego (EDRF) (15) i endogennym aktywatorem rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej (CG) (2,19).

II. CEL PRACY

Kontynuując badania zapoczątkowane przez Miścicką-Śliwkę i Szadujkis-Szadurskiego (23, 24, 25) nad pośmiertną reaktywnością tętnic podjęto próbę oceny wpływu czasu zgonu na reaktywność preparatów tętnic wyzwalaną przez arginino-wazopresynę oraz roli puli wewnątrz- i zewnątrzkomórkowej jonów Ca i NO w tym procesie.

Wapń i jego rola w organizmie budzi szerokie zainteresowanie w wielu dziedzinach medycyny (11, 17, 18, 20, 21). Analizowano również wpływ NO na reakcje naczyniowe (14). W dostępnym piśmiennictwie nie odnotowano jednak badań nad wpływem czasu zgonu oraz rolą puli wewnątrz- i zewnątrzkomórkowej jonów Ca i NO w pośmiertnej reaktywności tętnic.

III. MATERIAŁ I METODA

Badania prowadzono na perfundowanych tętnicach ogonowych szczura w czterech grupach czasowych: 0; 2; 4 i 8 godzin po zgonie (p.m.). Liczebność każdej z grup wynosiła n = 12. Samce szczurów rasy Wistar o wadze 250-300 g usypiano uretanem wstrzykiwanym dootrzewnowo w dawce 120 mg/kg. Po wypreparowaniu odcinka tętnicy o długości 3-3,5 cm i oczyszczeniu z otaczających tkanek, od strony proksymalnej wprowadzano kaniulę, którą następnie łączono z układem do perfuzji i zestawem umożliwiającym stały pomiar i rejestrację ciśnienia perfuzyjnego. Po obciążeniu dystalnego końca wypreparowanej tętnicy ciężarkiem 500 mg, preparat umieszczano w pozycji pionowej w naczyniu do narządów izolowanych o pojemności 20 ml. Naczynie w którym umieszczono tętnicę wypełniano natlenionym płynem fizjologicznym o temperaturze 37^oC. Do przepływu perfuzatu zastosowano pompę perystaltyczną. Przepływ zwiększano stopniowo, aż do uzyskania optymalnego przepływu wynoszącego 1 ml/minutę. Po tym przepływie rejestrowane ciśnienie perfuzyjne stabilizowało się na poziomie 40-60 mmHg. Czas stabilizacji preparatu wynosił około 1-1,5 godz.

Do badań używano dwa rodzaje płynu Krebsa: płyn EGTA - Ca²⁺ - Krebsa zawierającym Ca²⁺ o składzie: NaCl (71,8 mM), KCl (4,7 mM), CaCl₂ (1,7 mM), NaHCO₃ (28,4 mM), MgSO₄ (2,4 mM), KH₂PO₄ (1,2mM), EGTA (30mM) i glukoza (11,1 mM) oraz płyn EGTA - Krebsa bez Ca²⁺ o składzie: NaCl (71,8mM), KCl (4,7 mM), NaHCO₃ (28,4mM), MgSO₄ (2,4mM), KH₂PO₄ (1,2mM), EGTA (30mM) i glukoza (11,1 mM).

W doświadczeniach korzystano też z odczynników N^G-Methyl-L-arginine acetate salt; NMMA-Sigma-inhibitor NOS-syntazy, (Arg⁸) - Vasopressin acetate salt - AVP.

IV. WYNIKI BADAŃ

Z analizy danych przedstawionych w tabeli I i ryc. 1 dotyczących skurczu wyzwalanego przez AVP w płynie EGTA-Krebsa zawierającym Ca²⁺ wynika, że w miarę upływu czasu od zgonu dochodzi do obniżenia reaktywności tętnic. Zastosowanie inhibitora NOS blokującego syntezę NO wpływa na poprawę reaktywności tętnicy wyzwalanej przez AVP w obecności jonów Ca.

Tabela. I. Reaktywność tętnicy wyzwalana przez AVP w płynie EGTA Krebsa z Ca²⁺.

Table I. Reactivity of artery regulated by AVP in EGTA-Krebs with Ca²⁺.

Ryc. 1. Reaktywność tętnicy wyzwalana przez AVP w płynie EGTA Krebsa z Ca²⁺.

Fig. 1. Reactivity of artery regulated by AVP in EGTA-Krebs with Ca²⁺.

Tabela II. Reaktywność tętnicy wyzwalana przez AVP w płynie EGTA Krebsa bez Ca²⁺.

Table II. Reactivity of artery regulated by AVP in EGTA - Krebs Ca²⁺ free.

Ryc. 2. Reaktywność tętnicy wyzwalana przez AVP w płynie EGTA Krebsa bez Ca²⁺.

Fig. 2. Reactivity of artery regulated by AVP in EGTA - Krebs Ca²⁺ free.

Z analizy danych przedstawionych w tabeli II i ryc. 2 dotyczących skurczu wyzwalanego przez AVP z użyciem płynu EGTA-Krebsa nie zawierającego Ca²⁺ wynika, że w miarę upływu czasu od zgonu występuje systematyczne, w miarę regularne obniżanie reaktywności tętnicy. Zastosowanie inhibitora NOS nie chroni jednak przed obniżaniem reaktywności tętnicy w tym modelu badawczym.

IV. DYSKUSJA

Przeprowadzone badania wykazały, że na skurcz mięśniówki gładkiej tętnicy wyzwalany przez AVP ma wpływ pula wewnątrz i zewnątrzkomórkowa jonów Ca. Wykazano, że w płynie EGTA-Krebsa pozbawionym jonów Ca dochodzi do skurczu tętnic a więc musi być wykorzystana jedynie wewnątrzkomórkowa pula tego jonu. W miarę upływu czasu od zgonu dochodzi do obniżenia stężenia wewnątrzkomórkowych tych jonów, co prowadzi do obniżania się reaktywności tętnicy i spadku wartości ciśnienia perfuzyjnego. Dopiero dostarczenie jonów Ca z puli zewnątrzkomórkowej i uruchomienie mechanizmów umożliwiających transport Ca do wnętrza komórki pozwala na odzyskanie zdolności tętnicy do reakcji skurczowej nawet do 8 godzin. p.m.

Uzyskane wyniki są zgodne ze spostrzeżeniami Dreschera i wsp. (11) co do redukowania skurczu w sposób zależny od czasu. Boud'e i Breemen (6, 7) wykazali natomiast, że zablokowanie możliwości uzupełniania zapasów wewnątrzkomórkowych jonów Ca przy ponownym pobudzaniu nie wywoła skurczu.

Uzyskane wyniki, wskazujące na stosunkowo dobrą reaktywność tętnicy nawet po 8 godz. p.m. wiązać należy z zastosowaniem odmiennego modelu badawczego, opartego na uzupełnianiu wewnątrzkomórkowej puli Ca z przestrzeni zewnątrzkomórkowej.

Michols i wsp. (26) oceniając związki pomiędzy aktywacją określanej liczby α₁ receptorów a odpowiedzią komórkową dla przemieszczania wapnia wewnątrzkomórkowego wykazał, że mają one charakter hiperboliczny, co dowodzi, że dla tego procesu istnieje rezerwa receptorowa. Wpływ redukcji puli aktywnych receptorów na zmniejszanie reakcji naczyniowych w aspekcie czasu zgonu wykazali też Miścicka-Śliwka i Szadurski (23, 24, 25).

Przeprowadzone badania z zastosowaniem inhibitora NOS wskazują na istotny wpływ NO na pośmiertny spadek reaktywności preparatów tętnic ogonowych szczura wyzwalanych przez AVP w płynie EGTA-Krebsa zawierającym jony Ca. Potwierdza to także udział śródbłonkowej syntezy NO w procesie pośmiertnego hamowania reakcji skurczowej tętnic (27, 28). Zniesienie możliwości syntezy NO, czyli wyeliminowanie tego endotelialnego czynnika rozkurczowego pozwoliło bowiem na utrzymanie reaktywności tętnicy w 8 godz. p.m. na poziomie około 43% wartości ciśnienia perfuzyjnego uzyskiwanego w grupie 0 godz. p.m. w płynie EGTA-Krebsa zawierającym jony Ca gdy w tym samym czasie p.m. w płynie EGTA-Krebsa nie zawierającym jonów Ca uzyskane wartości ciśnienia perfuzyjnego stanowiły zaledwie 3% wartości uzyskanych w grupie 0 godz. p.m. Zahamowanie śródbłonkowej syntezy NO wyraźnie przedłuża pośmiertne reakcje skurczowe tętnicy na AVP z wykorzystaniem puli zewnątrzkomórkowej jonów Ca, nie ma natomiast wpływu na reakcje z wykorzystaniem puli wewnątrzkomórkowej jonów Ca.

Hypreaktywną rolę NO poprzez zablokowanie jego syntezy bądź anion ponadtlenkowy wykazali wcześniej Sieber i wsp. (30), Castro i wsp. (10) oraz Gryglewski (14).

Opisywane przez Clementi i wsp. (9) wyniki dotyczące regulacyjnej funkcji NO na homeostazę jonów Ca wskazywały, że kiedy komórki były preinkubowane z inhibitorami NOS to obserwowane efekty były przeciwne do tych wywoływanych z użyciem dawców NO. Z badań przeprowadzonych w niniejszej pracy wynika, że synteza NO jest fizjologicznie czynna również po zgonie a zablokowanie jego syntezy wpływa niemal czterokrotnie na poprawę reaktywności tętnicy w 8 godz. p.m. Autorzy zajmujący się tym zagadnieniem podkreślają jednak, że wpływ ten jest zróżnicowany w zależności od typu komórek i typu receptora. Tak więc stwierdzany w toku obecnego badania brak hamowania spadku reaktywności tętnic po zastosowaniu inhibitora NOS w płynie EGTA - Krebsa nie zawierającym jonów Ca wiązać można z typem badanego receptora.

V. WNIOSKI

1. W miarę upływu czasu od zgonu dochodzi do obniżenia reaktywności tętnicy na arginino-wazopresynę.

2. Wzrost reaktywności tętnicy po zastosowaniu inhibitora syntazy NO wskazuje, że śmierć nie powoduje natychmiastowego przerwania procesu syntezy NO.

3. Zastosowane modele badawcze zarówno z wykorzystaniem puli wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowej jonów Ca wskazuje na ich przydatność do ustalania czasu zgonu.

4. Czas pośmiertnej reakcji skurczowej tętnicy, wyzwalanej przez AVP ulega istotnemu wydłużeniu po uzupełnieniu jonów Ca z puli zewnątrzkomórkowej i po zahamowaniu syntezy NO.

VI. PIŚMIENNICTWO

1. Adelstein R.S., Eisenberg R.: Regulation and Kinetics of actino-myosin ATP interaction. Annn Rev. Biochem. 1980, 49, 921. - 2. Arnold W.P., Mittal C.K., Katsuki S., Murad F.: Nitrie oxide activates guanylate cyclase and increases guanosine 3',5'-cyclic monophosphate levels in varians tissue preparations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977, 74, 3203-3207. - 3. Barnard E.A.: Seperating receptor subtypes from their shadows. Nature 1988, 35, 301. - 4. Berridge M.J., Irvine R.F.: Inositol phosphates and cell signalling. Nature, 1989, 341, 197. - 5. Birnbaumer L.G.: G proteins in signal transduction. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol 1990, 30, 675. - 6. Bond M., Kitazawa T., Samlyo AP., Samlyo AV.: Release and recycling of Ca²⁺ by the sarcoplasmie reticulum in guinea-pig portal vein smooth muscle. J. Physiol 1984, 355, 677. - 7. Breemen Cvan., Saida K.: Cellular mechanisms regulating (Ca²⁺) smooth muscle. Annu Rev Physiol 1989, 51, 315. - 8. Bunting S., Gryglewski R., Moucada S., Vane J.R.: Arterial walls generate from prostaglandin endoperoxides a substance which relaxes strips of meseuteric and coeliac and inhibits platelet aggregation. Prostaglandins 1976, 12, 897-913. - 9. Clementi E., Vecchio I., Corasanti M.T., Nistico G.: Nitric oxide modulates agonisteroked Ca²⁺ release and influx responses in PC 12-64 cells. Europen J. of Pharmacology 1995, 289, 113-123. - 10. Castro A., Jimenez W., Claria J., Ros J., Martinez J.M., Bosch M.: Imparired responsiveness to angiotensin II in experimental cirrhosis: role of nitric oxide Hepatology 1993, 18, 367.

11. Drescher P., Eckert R.E., Madsen P.O.: Role of intracellular Ca²⁺ stores in smooth muscle contractions of the guinea pig vas deferens. Urol. Res 93, 21, 319-323. - 12. Furchgott R.F., Zawadzki J.U.: The obligatory role of the endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylocholine. Nature 1981, 288, 373-376. - 13. Gryglewski F. J., Bieroń K., Dembińska-Kieć A., Zembowicz A.: Interaction between prostacyclin and molsidomine in blood cells and plasma. Advaced in Prostaglandin, Tromboxane and Leukotrienie Research. Raven Press, New York 1990, 21 (B), 665. - 14. Gryglewski R. J., Palmer R. M. J., Moncada S.: Superoxide anion is involved in breakdown of endothelium - derived vascular relaxing factor. Nature, 1986, 320, 454. - 15. Griffith O.W., Stuehr D.J.: Nitric oxide synthases: properties and catalytic mechanism. Ann Rev Physiol 1995, 57, 707-736. - 16. Gurney A.M., Clapp L.H.: Calcium channels and vasoolilation. Adv Mol Cell Biol 1994, 8, 21-34; - 17. Hamada H., Damron D.S., Hong S.J., Wagoner D.R., Murray P.A.: Phenylephrine - Induced Ca2+ Oscillations in Canine Pulonary Artery Smooth Muscle Cells. Circulation Research 1987, 81, 5, 812-822. - 18. Hartleb M., Morean R., Gaudin Ch., Lebrec D.: Lack of vascular hyporesponsiveness to the l-type calcium chanuel activator, Bay K 8644, in rats with cirrhosis. Journal of Hepatology 1995, 22, 202-207. - 19. Ignarro L.J., Kadowitz P.J.: The pharmacological and physiological role of cyclic GMP in vascular smooth muscle relaxation. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1985, 25, 171-191. - 20. Kin S-J., Kudej R. i wsp.: A novel mechanism for Myocardical Stunning Involving Impaired Ca²⁺ Handling. Circ. Res. 2001, 89, 831-837.

21. Leprêtre N., Mironneau J.: α₂ Arenoceptors activate dihydropyridine - sensitive calcium channels via Gi-proteins and protein Kinase C in rat portal vein myocytes. Pflügers Ach. Eur J. Physiol 1994, 429, 253-261. - 22. Moncada S., Palmer R.M.J., Higgs E.A.: Nitric oxide physiology, pathophysiology and pharmacology. Pharmacol. Rev 1991, 43, 109-142. - 23. Miścicka-Śliwka D.: Ocena pośmiertnej reaktywności tętnicy ogonowej szczura na fenylefrynę i jej znaczenie dla określenia czasu śmierci. Praca habilitacyjna. Bydgoszcz 1987. - 24. Miścicka-Śliwka D., Szadujkis-Szadurski L.: The study of post - mortem changes in alpha - 1-adrenoreceptor function. Advances in Forensic Sciences. Forensic criminalistics 2. Vol. 4. 107-110. - 25. Miścicka-Śliwka D., Szadujkis-Szadurski L.: Analiza farmakokinetyczna pośmiertnych reakcji alfa-adrenergicznych tętnic. Post. Med. Sąd. i Krym. 1995, 2, 71. - 26. Michols A.J., Ruffolo RR Jr.: The relationship of alfa-adrenoceptor reserve and agonist intrinsic efficacy to calcium utilization in the vasculature. Trends Pharmacol Sci. 1988, 9, 236. - 27. Palmer R.M.J., Rees D.D., Ashton D.S., Moncada S.: L-Arginine is the physiological precursor for the formation of nitric oxide in endothelium-dependent relaxation. BiochemBiophys Res Commun 1988, 153, 1251-1256. - 28. Rees D.D., Palmer R.M.J., Moncada S.: The role of endothelium deriveol nitric oxide in the regulation of blood pressure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 3375-3378. - 29. Sessa W.C.: The Nitric Oxide Synthase Family of proteins. J Vasc Res 1994, 31, 131-143. - 30. Sieber CC., Groszmann RJ.: Nitric oxide meditates hyporeactivity to vasopressors in mesenteric vessels of portal hypertensive rats. Gastroenterology 1992, 103, 235.

31. Śliwka K., Szadujkis-Szadurski L.: Badania doświadczalne nad reaktywnością tętnic w okresie interletalnym na adrenergiczne działanie noradrenaliny. Ann. Acad. Gedan. 1980,10,267.

Adres autora:

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej AM

ul. Marii Skłodowskiej-Curie 9

85-094 Bydgoszcz