Renata Jacewicz, Adam Prośniak, Jarosław Berent, Stefan Szram

Genetyka populacyjna układu D1S80 w regionie centralnej Polski

Population genetics of the D1S80 system in a Central Poland region

Z Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi

Kierownik: prof. dr hab. S. Szram

Przedstawiono bazę danych dotyczącą układu D1S80 opracowaną na podstawie analizy 775-osobowej próby populacyjnej z regionu Polski centralnej. Wykazano stan równowagi Hardy’ego i Weinberga (HWE) z zastosowaniem dwóch niezależnych podejść statystycznych. Przeprowadzono ocenę następujących parametrów przydatności markera do badań w analizowanej populacji: heterozygotyczności - 0.79, PIC - 0.77, PD - 0.93, PE - 0.62, PI - 12.8 oraz współczynnika mutacji - 0.27%.

Population data concerning the D1S80 system based on the analysis of 775 persons from Central Poland region was presented. Accordance with the Hardy and Weinberg equilibrium (HWE) was proved using two different statistical approaches. The parameters for the appriopriateness of this marker for investigations in the analysed population was also assesed: heterozygosity - 0.79, PIC - 0.77, PD - 0.93, PE - 0.62, PI - 12.8 and frequency of mutation events - 0.27%.

Słowa kluczowe: lokus D1S80, HWE, populacja Polski centralnej

Key words: D1S80 locus, HWE, Central Poland population

WSTĘP

Lokus D1S80 zlokalizowany na krótkim ramieniu chromosomu pierwszego z 16 pz. jednostką powtarzalną i długością alleli 350-900 pz. to pierwszy system oznaczany techniką PCR w badaniach sądowych w Polsce, w latach dziewięćdziesiątych będący w obowiązkowym zakresie analiz spornego ojcostwa (20). Heterozygotyczność tego bimodalnego układu waha się w granicach: 0.77-0.85 i wiąże się ze stosunkowo wysokimi wartościami siły dyskryminacji i teoretycznej szansy wyłączania (7, 18, 19, 21). Charakterystyka lokus D1S80 została przeprowadzona dotąd w próbach populacyjnych pochodzących z Polski północnej (16), Polski północno-wschodniej (17), Polski południowej (22), Polski południowo-wschodniej (4), rejonu Pomorza-Kujaw (12), Wielkopolski (9), Górnego i Dolnego Śląska (5,18). Ponadto statystyczna analiza porównawcza rozkładu cech D1S80 w tych regionach wykazała, iż populacja Polski nie jest jednorodna (18). Uzasadnia to potrzebę wypełnienia luki populacyjnej i opracowania własnej bazy danych do obliczeń, co stanowi przedmiot niniejszego opracowania.

MATERIAŁY I METODY

Materiał do badań stanowiła krew pochodząca od osób uczestniczących w 384 ekspertyzach dochodzenia spornego ojcostwa i 15 sprawach kryminalistycznych wykonywanych w Katedrze Medycyny Sądowej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi. DNA do badań uzyskano wykorzystując metodę solną izolacji z pełnej krwi (10) bądź z plam w oparciu o membrany jonowymienne wiążące DNA - Spin 10X (zestaw firmy A&A Biotechnology). Amplifikację fragmentów prowadzono wykorzystując zestaw Ampli FLP D1S80 firmy Applera, zgodnie z zaleceniami producenta. Produkt po amplifikacji rozdzielano metodą wertykalnej elektroforezy w nieciągłym systemie buforowym (0,5 x TBE), z wykorzystaniem 6% żelu poliakrylamidowego (Gene Amp firmy Applera) i barwienia srebrem wobec markera wielkości alleli D1S80. Dla uzyskanych rozkładów alleli podano ich częstości oraz górny przedział ufności - UCL (ang. upper confidence limit) dla poziomu ufności 0.95 wg Budowle i Monsona (3). Analiza statystyczna stanu równowagi HW została przeprowadzona w oparciu o test exact z zastosowaniem programu komputerowego GDA (11), a także w oparciu o test chi ² i test Carmody’ego z pakietu RXC jego autorstwa.

Ocenę przydatności układu do badań przeprowadzono w oparciu o analizę następujących parametrów: heterozygotyczności obserwowanej i oczekiwanej (14), zawartości informacji polimorficznej (PIC) (2), siły dyskryminacji (PD) (13), teoretycznej szansy wyłączenia (PE) (23), szansy ojcostwa (1) i współczynnika mutacji.

WYNIKI I OMÓWIENIE

Uzyskany rozkład alleli D1S80 w populacji centralnej Polski charakteryzuje się pełnym zestawem alleli w zakresie 15-41 powtórzeń 16 pz motywu, bez występowania interalleli, z charakterystycznym bimodalnym rozkładem cech (tabela I).

Tabela I. Rozkład alleli D1S80 w próbie 775 niespokrewnionych dorosłych

z regionu centralnej Polski.

Table I. Distributon of D1S80 alleles in a sample of 775 unrelated adults from

Central Poland.

Równowagę stanu Hardy’ego i Weiberga w badanej populacji sprawdzano dwoma niezależnymi metodami. Ocena zgodności rozkładu obserwowanego i oczekiwanego w populacji niespokrewnionych 775 dorosłych, przeprowadzona w oparciu o test exact, nie wykazała odchyleń od stanu HWE. W kolejnym etapie analizowano znamienność różnic między dwoma kolejnymi pokoleniami biorąc pod uwagę populację 386 niespokrewnionych dzieci (nie prezentowane dane). Z prawa Hardy’ego i Weinberga wynika, że populacja znajduje się w stanie równowagi wtedy, kiedy częstości alleli przy przechodzeniu z jednej generacji do drugiej pozostają niezmienne. Uzyskane wysokie wartości prawdopodobieństwa w testach chi kwadrat i Carmody`ego potwierdzają, że rozkład cech w układzie D1S80 w centralnej Polsce jest zgodny z prawem Hardy’ego i Weiberga (tabela II).

Tabela II. Ocena równowagi Hardy`ego i Weinberga w populacji Polski centralnej.

Table II. Evaluation of the Hardy and Weinberg equilibrium in a Central Poland population.

n- liczba osób niespokrewnionych

n- number of unrelated persons

Wskaźniki stopnia polimorfizmu układu D1S80 w badanej populacji zestawiono w tabeli III. Heterozygotyczność obserwowana odpowiada heterozygotyczności oczekiwanej i mieści się w przedziale heterozygotyczności, obserwowanym w innych populacjach Polski: 78.85-84.96% (4, 16, 18, 22). Uzyskane wartości współczynnika dyskryminacji nie odbiegają od analogicznych wartości w innych populacjach: 92.00-94.14% (7, 16, 18, 19, 21), co potwierdza znaczny stopień zmienności układu i jego przydatność do różnicowania osób w rejonie Polski centralnej.

Analizę przydatności układu do badań ojcostwa oceniano obliczając wartości teoretycznej siły wyłączenia i szansy ojcostwa, które zestawiono w tabeli IV.

Teoretyczna szansa wyłączenia mieści się w przedziale wartości uzyskanych w innych populacjach: 60,30-64.90% (8, 18, 21) i nie odbiega od wartości faktycznej siły wyłączeniowej układu uzyskanej na podstawie analizy 384 spraw o ustalenie ojcostwa - 60.76%. Analiza układu D1S80 zwiększa szansę ojcostwa od 0.82 do 1550 razy, a średnia wartość tego parametru w badanej populacji wynosi 12.8.

Tabela III. Parametry polimorfizmu układu D1S80 w populacji Polski centralnej (n=775).

Table III. Parameters of polymorphism for the D1S80 system in a population of Central Poland (n=775).

H obs. (observed heterozygosity) - heterozygotyczność obserwowana

H ocz. (expected heterozygosity) - heterozygotyczność oczekiwana

PIC (polymorphism information content) - zawartość informacji polimorficznej

PD (power of discrimination) - siła dyskryminacji

Tabela IV. Parametry przydatności układu D1S80 do badań ojcostwa w populacji Polski centralnej.

Table IV. Parameters for usefulness of the D1S80 system for paternity testing in a Central Poland population.

PE (power of exclusion)- siła wyłączenia

PI (paternity index) - szansa ojcostwa

Kolejnym elementem analizy była ocena częstości występowania mutacji w lokus D1S80 biorąc pod uwagę 385 mejoz matczynych i 342 mejoz ojcowskich. Ojcostwo lub macierzyństwo zostało potwierdzone na podstawie badania jednego/dwóch układów typu MLP oraz co najmniej 4 wysoce polimorficznych układów typu SLP. Wyniki analizy zebrano w tabeli V. Całkowity wpółczynnik mutacji układu wyniósł 0,275% w badanej populacji. W ośrodku wrocławskim ujawniono 2 przypadki mutacji w całkowitej liczbie 741 analizowanych mejoz, co daje bardzo zbliżoną wartość współczynnika mutacji układu 0,270% (6). Analiza 2462 mejoz przeprowadzona w populacji czeskiej ujawniła wartość całkowitą współczynnika mutacji układu D1S80- 0.203% (0.162% w mejozach matczynych i 0.244% w mejozach ojcowskich).

Tabela V. Analiza częstości mutacji w lokus D1S80 w populacji Polski centralnej.

Table V. Analysis of mutation event frequency in locus D1S80 in a Central Poland population.

PODSUMOWANIE

Wykazano zgodność z równowagą Hardy`ego i Weinberga populacji Polski centralnej w zakresie rozkładu cech w lokus D1S80 stosując dwie niezależne metody statystyczne. Uzyskane rozkłady alleli oraz obliczone wartości parametrów biostatycznych potwierdzają przydatność układu D1S80 w analizach sądowych w badanej populacji i pozwalają na obliczenia wartości szansy ojcostwa i siły dyskryminacji w konkretnych ekspertyzach. Przeprowadzone obliczenia ujawniły nie braną wcześniej pod uwagę wartość wskaźnika częstości mutacji w lokus, wynoszącą w populacji Polski centralnej 0.275%.

PIŚMIENNICTWO

1. Berent J.A., Miścicka-Śliwka D., Czarny J.: Średnie wartości szansy ojcostwa - obliczenia dla populacji polskiej. Arch. Med. Sąd. Krym., 1999, 49, 11-15 - 2. Botstein D., White R.L., Skolnick M., Davis R.W.: Construction of genetic linkage map in man using restriction fragment lenght polymorphism. Am. J. Hum. Genet., 1980, 32, 314-331. - 3.Budowle B., Monson K.L.: Perspectives on the fixed bin method and the floor approach/ ceiling principle. Proceedings from the Fourth International Symposium on Human Identification, Promega Corporation 1992, Madison WI, 391-406. - 4.Ciesielka M., Koziol P., Krajka A.: Allele frequency distributions of D1S80 in the Polish population. Forensic Sci. Int., 1996, 81, 141-147. - 5.Dobosz T.: Częstości wybranych genów warunkujących polimorfizm genetyczny w obrębie populacji dolnośląskiej. Rozprawa na stopień doktora habilitowanego. Wrocław 2000, 55-58. - 6.Dobosz T., Dmochowska G., Kowalczyk E., Szczepaniak M., Jagielski J.: Przypadki "wewnętrznej sprzeczności" poszczególnych elementów ekspertyzy DNA w sprawach o ustalenie spornego ojcostwa. Post. Med. Sąd. i Krym., Wrocław 1997, 323-327. - 7. Kloosterman A.D., Budowle B., Daselaar P.: PCR-amplification and detection of the human D1S80 VNTR locus. Amplification conditions, population genetics and application in forensic analysis. Int. J. Leg Med., 1993, 105, 257-264. - 8. Kozioł P., Ciesielka M.: Ocena przydatności badań VNTR lokus D1S80 w sprawach spornego ojcostwa. Arch. Med. Sąd. Krym., 1994, 44, 459-465. - 9.Kwiatkowska J., Dziechciowska K., Lisiecka D., Słomski R.: DNA polymorphism in locus D1S80 in Poland. DNA profiling and detection of a new alleles by heteroduplex formation between alleles of the same size. J. Appl. Genet.,1997,38. - 10. Lahiri D.K., Nurnberger Jr. J. I.: A rapid non enzymatic method for RFLP studies. Nucleic Acids. Res., 1991, 19, 5444.

11. Lewis P.O., Zaykin D., Genetic Data Analysis: Computer program for the analysis of allelic data. Version 1.0, 1997, http://chee.unm.edu/gda/ 224. - 12. Miścicka-Śliwka D., Syroczyńska A., Śliwka K., Berent J.A.: Investigation of D1S80 VNTR lokus in a Polish population. Acta Med. Leg., 1994, 44, 72-73. - 13. National Research Council Report II. The Evaluation of Forensic DNA Evidence. National Academy Press, Washington D. C. 1996, 96-97. - 14. Nei M., Roychoudhury A. K.: Sampling variances of heterozygosity and genetic distance. Genetics 1974, 76, 379-390. - 15.Paternity testing workshop of the English Speaking Working Group of the IFSG, 2002 (draft report). - 16.Pawłowski R.: Polimorfizm lokus D1S80 człowieka w populacji Polski Północnej, badany techniką PCR. Genetyka populacyjna oraz zastosowanie do badania śladów biologicznych Arch. Med. Sąd. Krym., 1995, 45, 247-256. - 17.Pepiński W., Skawrońska M., Janica J.: Human population genetics of the VNTR locus D1S80 in the north-eastern Poland., 1996, Rocz. Akad. Med. Białymst. 41, 316-320. - 18. Raczek E., Polimorfizm układu D1S80 w populacji Górnego Śląska; jego przydatność w badaniach spornego ojcostwa., Arch. Med. Sąd. Krym., 2000, 50, 57-65. - 19. Sajantila A., Budowle B., Ström M., Johnsson V., Lukka M., Peltonen L., Ehnoholm Ch.: PCR amplification of alleles at D1S80 locus: comparision of a Finish and a North American Caucasian population sample, and forensic casework evaluation. Am. J. Hum. Genet., 1992, 50, 816-825. -20. Stojanowska W, Miścicka-Śliwka D.: Dowód z badań DNA, a inne dowody w procesach o ustalenie ojcostwa, Wydawnictwo Prawnicze, W-wa 2000, 129.

21.Thymann M., Nellemann L.J., Masumba G., Irgens-Möller L., Morling N.: Analysis of the locus D1S80 by amplified fragment lenght polymorphism technique (AMP-FLP). Frequency distribution in Danes. Intra and inter labolatory reproducibility of the technique. For. Sci. Int., 1993, 60, 47-56. - 22.Turowska B., Sanak M., D1S80 VNTR locus genotypes in population of south Poland; meta-analysis pointer to genetic disequilibrium of human populations., Forensic Sci. Int., 1995, 75, 207-216. - 23. Weir B.S. Genetic Data Analysis II. Sinauer Associates, Inc. Publishers, Sutherland, Massachusetts 1996, 101-108, 209-211.

Adres pierwszego autora:

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej UM w Łodzi

ul. Sędziowska 18 a

91-304 Łódź

e-mail: This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.