Polimorfizm lokus STR LPL w populacji Górnego Śląska

Z Katedry Medycyny Sądowej Śląskiej AM w Katowicach

Kierownik: dr hab. n. med. Z. Olszowy - profesor Śląskiej AM

Praca przedstawia wyniki badań lokus LPL w populacji Górnego Śląska. Badania przeprowadzono w grupie 147 osobników. Obserwowano następujące częstości alleli: LPL*9=0.0578; LPL^*10=0.4048; LPL^*11=0.2517, LPL^*12=0.2449 i LPL^*13=0.0408. Wartości charakteryzujące polimorfizm układu to: siła dyskryminacji PD = 0.8581, heterozygotyczność obserwowana Ht_obs.= 0.7211, heterozygotyczność oczekiwana Ht_{ocz. =} 0.7102, prawdopodobieństwo przypadkowej zgodności profili genetycznych PM = 0.1419, siła wykluczeniowa układu MEC = 0.4580, współczynnik informacji polimorficznej PIC = 0.6569, średnie prawdopodobieństwo wykluczenia MEP = 0.4616. Badana populacja znajduje się w równowadze genetycznej zgodnej z prawem Hardy'ego-Weinberga. Częstości genowe są zbliżone do obserwowanych w dwóch innych populacjach polskich. Populacja polska wykazuje homogenność.

This paper shows the results of locus LPL in the population of Upper Silesia. The examinations were performed in a group of 147 unrelated adults. The following gene frequencies were observed: LPL*9=0.0578; LPL^*10=0.4048; LPL^*11=0.2517, LPL^*12=0.2449 i LPL^*13=0.0408. DNA was isolated using Blood DNA Prep Plus of A&A Biotechnology. Amplification was carried out in a Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400 thermal cycler, using the GenePrint STR System LPL (8p22) of Promega Corporation, Madison, WI, USA. PCR products were electrophoretically separated by high-resolution polyacrylamide gel - GDG of Perkin Elmer. Gels were stained by the silver method. Test c ², exact and Carmody’s were used for statistical estimation. The identification values of the system are: PD, Ht, PM, MEC, PIC, MEP. The analysis of studies has shown that the examined population is in the genetic equilibrium conformable to the Hardy-Weinberg’s principle. The estimated gene frequencies are similar to those observed in two Polish populations.

Słowa kluczowe: lokus LPL, populacja Górnego Śląska, genetyka populacyjna, analiza statystyczna.

Wprowadzenie

Polimorficzny układ LPL jest jednym z markerów genetycznych stosowanych w hemogenetyce sądowej. Badane sekwencje LPL leżą w 6 intronie ludzkiego genu lipazy lipoproteinowej. Lokus LPL zlokalizowany jest na krótkim ramieniu w autosomalnym chromosomie 8 w regionie p22 (8). Polimorfizm układu LPL wynika ze zmiennej liczby powtórzeń sekwencji czteronukleotydowej AAAT. Długość amplifikowanych fragmentów wynosi od 105 dla allelu 7 do 133 par zasad dla allelu 14 (8).

Badania populacyjne układu LPL prowadzono w wielu regionach Europy, Azji i Afryki (4, 5, 7, 13). W Polsce oznaczano polimorfizm LPL w dwóch regionach: Polsce Południowej i Polsce Południowo-Wschodniej (3, 6, 12).

Celem niniejszej pracy było:

• określenie częstości występowania alleli z lokus LPL w populacji Górnego Śląska; ocena zgodności rozkładu alleli z prawem Hardy’ego-Weinberga;
• porównanie rozkładu częstości występowania alleli w badanej populacji z populacją Polski Południowej i Polski Południowo-Wschodniej, populacjami europejskimi i wybranymi populacjami świata (test homogenności);
• obliczenie parametrów oceniających przydatność układu LPL w medycynie sądowej.

Materiał i metodyka

Materiał do badań populacyjnych stanowiły 147 próbki krwi pochodzące od osób dorosłych, niespokrewnionych, płci męskiej i żeńskiej. Krew pobraną na EDTA wylewano na bibułę filtracyjną i suszono. Z suchych plam izolowano DNA zestawem do izolacji DNA - Blood DNA Prep Plus firmy A&A Biotechnology.

Amplifikację wykonywano metodą PCR (1,2) zgodnie z rekomendacją producenta zestawu GenePrint STR System LPL firmy Promega Corporation, Madison, WI, USA (8). Produkty amplifikacji PCR rozdzielano techniką elektroforezy wertykalnej (aparat do elektroforezy S 2001 firmy Life Technologies firmy Gibco BRL) w systemie buforowym, na żelu poliakrylamidowym GDG firmy Perkin Elmer. Barwienie elektroforegramów wykonywano metodą srebrową (2). Allele określano porównując z “drabinami alleli” firmy Perkin Elmer (8).

Opracowanie wyników stanowiło wyliczenie obserwowanych i oczekiwanych liczebności i częstości genotypów przy zastosowaniu równania Hardy’ego-Weinberga. W badaniach statystycznych ocenę zgodności między oczekiwanymi i obserwowanymi genotypami prowadzono z zastosowaniem testu c ² przy 10 stopniach swobody df=10 i testu Exact z zastosowaniem programu TFPGA. Charakterystyka statystyczna lokus LPL obejmuje również następujące parametry statystyczne świadczące o przydatności układu w medycynie sądowej: PD - siła dyskryminacji, PE - siła wykluczająca układu, PIC - zawartość informacji polimorficznej, PM - prawdopodobieństwo przypadkowej zgodności, średnie prawdopodobieństwo wykluczenia MEP, Ht - heterozygotyczność układu (wg obowiązujących wzorów). Do obliczeń stosowano program FatRec.

Porównanie homogenności rozkładu alleli pomiędzy badaną populacją a innymi populacjami przeprowadzono testem Carmody’go. Program ten dokonuje obliczeń kreując 1000 symulowanych tabel zawierających sumaryczną liczbę alleli, jak dla wartości obserwowanych.

Wyniki i dyskusja

W grupie 147 osób dorosłych, niespokrewnionych, płci męskiej i żeńskiej stwierdzono obecność pięciu alleli: 9, 10, 11, 12, i 13 z 9 alleli wymienionych w piśmiennictwie (3, 4, 5, 6, 7, 12, 13).

W badaniach nie natrafiono na allele 7, 8, 14 i 16. Najczęściej występującym allelem w populacji Górnego Śląska jest 10-40.5% populacji, 11-25.2% i 12-24.5%, najrzadszym 13 - 4.1% populacji.

Obserwowano obecność czternastu genotypów: 9-9, 9-10, 9-11, 9-12, 9-13, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 11-11, 11-12, 11-13, 12-12 i 12-13, spośród piętnastu możliwych dla pięciu spotkanych alleli. Najrzadziej występującym genotypem jest 9-9 i 9-13, zaś najczęstszym 10-12. W badanym lokus nie stwierdzono interalleli.

Tabela I przedstawia częstości występowania genotypów obserwowanych i oczekiwanych w układzie LPL u 147 osób niespokrewnionych oraz częstości występowania alleli w badanej populacji.

Analiza danych w oparciu o test c ² wykazała, że badana populacja Górnego Śląska w obrębie lokus LPL znajduje się w równowadze genetycznej zgodnej z prawem Hardy'ego-Weinberga dając wartości c ²=3.9747 przy 10 stopniach swobody i p=0.9485 z uwagi na zgodność między danymi oczekiwanymi i obserwowanymi. Różnice między wartościami obserwowanymi i oczekiwanymi nie są statystycznie istotne. Badanie zgodności rozkładu genotypów obserwowanych i oczekiwanych z wykorzystaniem testu Exact metodą Monte Carlo i Markov-Chain dało wartość p=0.8625 i p=0.8460 przy S.E=0.0103414 i S.E.=0.0232604, co również potwierdziło spełnienie prawa genetyki populacyjnej.

Rycina 1 pokazuje graficzne porównanie częstości poszczególnych alleli układu LPL w populacji Górnego Śląska.

Porównanie częstości występowania alleli w badanym lokus w populacji Górnego Śląska i dwóch regionach Polski przedstawia tabela II. Jedynie w obrębie allelu 13 nastąpiła zauważalna odmienność częstości tegoż allelu, nie wpływająca jednak na dalszy przebieg analizy statystycznej. Zaobserwowana niejednorodność wynika prawdopodobnie z różnic regionalnych. Wysoka wartość prawdopodobieństwa zgodności z prawem Hardye’go-Weinberga (p=0.9485) świadczy o poprawnym genotypowaniu.

W tabeli III porównano rozkład częstości genowych systemu LPL w populacji Górnego Śląska z rozkładem częstości genowych w regionie Polski Południowej (12) i Polski Południowo-Wschodniej (3, 6) testem homogenności (test Carmody’ego). W teście nie wykazano znamiennych statystycznie różnic dla badanych alleli LPL pomiędzy populacją Górnego Śląska, a populacjami Polski Południowej i Południowo-Wschodniej. Również populacja Polska jest homogenna.

Tabela I. Liczebność i częstość obserwowana i oczekiwana genotypów oraz częstość alleli lokus LPL w populacji Górnego Śląska.

Table I. Observed and expected number and frequency of genotypes and allele frequencies of the LPL system in the Upper Silesia population.

Ryc. 1. Graficzne przedstawienie częstości poszczególnych alleli lokus LPL dla populacji Górnego Śląska.

Fig. 1. Graphical comparison of allele frequencies of the LPL system in the Upper Silesia population.

Tabela II. Porównanie częstości alleli lokus LPL w populacji Górnego Śląska i innych regionach Polski.

Table II. Comparison of the allele frequencies locus LPL in the population of Upper Silesia to other Polish population samples.

Tabela III. Homogenność populacji polskiej - test Carmody’ego.

Table III. Homogeneity of Polish population - Carmody’s test.

W tabeli IV zebrano wyniki statystycznego porównania homogenności rozkładu częstości alleli LPL pomiędzy badaną populacją Górnego Śląska a populacjami Europy. Z przeprowadzonych badań z zastosowaniem testu Carmody’ego wynika, że otrzymane w teście wartości p wskazują na odrzucenie hipotezy zgodności rozkładu alleli LPL jedynie pomiędzy populacją Górnego Śląska i Romów Węgierskich z uwagi na istotne różnice. Wyłączenie populacji Romów Węgierskich z obliczeń w teście Carmode’go pozwoliło na stwierdzenie, że populacja europejska jest homogenna - nie wykazano znamiennych statystycznie różnic dla badanych alleli LPL.

Tabela IV. Homogenność populacji Górnego Śląska z innymi populacjami Europy test Carmody’ego.

Table IV. Homogeneity of the population of Upper Silesia and other European populations - Carmody’s test.

Tabela V obrazuje statystyczne porównanie homogenności rozkładu częstości alleli pomiędzy badaną populacją Górnego Śląska, a innymi populacjami świata. W lokus LPL na poziomie istotności 0.05 populacja Marokańczyków i Białych Amerykanów nie wykazała znamiennych statystycznie różnic (8, 13). Natomiast znamienne statystycznie różnice w rozkładzie alleli obserwowano w badanych populacjach: Japończyków, Chińczyków, Papuasów, Aborygenów, Czarnych Amerykanów i Hiszpańskich Amerykanów (8, 13).

Tabela V. Homogenność populacji Górnego Śląska z innymi populacjami świata - test Carmody’ego.

Table V. Homogeneity of the population of Upper Silesia and other world populations - Carmody’s test.

W tabeli VI ukazano charakterystykę statystyczną układu LPL, gdzie: siła dyskryminacji PD = 0.8589, heterozygotyczność obserwowana i oczekiwana wynosi 0.7211 oraz 0.7102 ± 0.0109, prawdopodobieństwo przypadkowej zgodności profilu genetycznego PM - 0.1419, zawartość informacji polimorficznej - wartość PIC 0.6569, wreszcie siła wykluczająca układu PE odpowiednio równa się 0.4616.

Tabela VI. Wartości statystyczne lokus LPL wyliczone na podstawie badań

własnych.

Table VI. Statistical parameters of the LPL system estimated on my own

examinations.

Dla zobrazowania przydatności lokus LPL w tabeli VII przedstawiono porównanie parametrów statystycznych tego lokus z parametrami innych markerów genetycznych (CSF1PO, TPOX, TH01, F13B, HPRTB, F13A01, FESFPS, VWA, D13S317, D7S820, D16S539) (3, 6, 9, 10, 11, 12).

Tabela VII. Porównanie własności statystycznych układu LPL z innymi układami STR.

Table VII. Comparison of statistical parameters of the LPL system with other systems.

Uzyskane wartości statystyczne charakteryzujące lokus STR LPL istotne dla badań spornego ojcostwa i identyfikacji śladów biologicznych nie odbiegają od wyników uzyskanych dla innych regionów Polski (6, 12).

Zestawione parametry statystyczne, które stanowią ważny element przy przeprowadzaniu badań i wydawaniu opinii wskazują, że układ ten może stanowić użyteczne narzędzie w identyfikacji osobniczej ze wskazaniem na dużą przydatność tego markera w badaniach kryminalistycznych. Parametry te kształtują się podobnie jak dla systemów STR F13B, CSF1PO, TPOX, FESFPS. Wartość współczynników MEP i MEC, wskazuje że marker LPL może być z dużym powodzeniem stosowany w badaniach kompleksowych w połączeniu z innymi markerami DNA.

Piśmiennictwo

1. Allen R.C., Graves G., Budowle B.: Polymerase chain reaction amplification products separated on rehydratable polyacrylamide gels and stained with silver. Bio Techniques 1989, 7, 736. -2. Bassam B.J., Caetano-Annolles G., Gresshoff P.M.: Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 1991, 196, 80-83. -3. Czerski T., Kozioł P., Monies D., Mądro R.: Badania układu F13B w populacji Polski Południowo-Wschodniej. Z Zagadnień Nauk Sądowych 1998, 38, 126-137. -4. Füredi S., Kozma Z., Woller J., Pádár Z., Angyal M., Bajnóczky I., Nishi K.: Population genetic data on four STR loci in a Hungarian Romany population. Int. J. Legal Med., 1998, 112, 72-74. -5. Füredi S., Woller J., Pádár Z.: A population study of the STR loci HumLPL, HumF13B and HumF13A01 in Hungary. Int.J.Legal Med. 1997, 110, 107-108. -6. Kozioł P., Czerski T., Mądro R.: HumF13B, HumLPL and HumHPRTB in southest Poland. Int. J. Legal Medicine 1999, 113, 55-57. -7. Martin P., Garcia O., Albarrán C., Sancho M.: A Spanish population study of the STR loci HumLPL, D5S818, D7S820 and D13S317. Int. J. Legal Med. 1998, 112, 70-71. -8. Promega Corp. Gene Print^TM STR Systems (Silver Stain Detection), Revised ed., June 1998. -9. Raczek E.: Population data on the three STR (FFV) loci in the Upper Silesia (Poland). J. Forensic Sci., 2001, 46, 6, 1522. -10. Raczek E.: Population data on the three STR loci in the Upper Silesia (Poland). J.Forensic Sci., 2002, 47, 1, 228.

11. Raczek E., Droździok K., Kabiesz J.: Polimorfizm loci typu STR: TH01, TPOX i CSF1PO w populacji Górnego Śląska; ich przydatność do badań spornego ojcostwa. Z Zagadnień Nauk Sądowych 2001, 45, 81-92. -12. Turowska B, Sanak M., Opolska-Bogusz B.: Częstości alleli układów STR: LPL, F13B i HPRTB w populacji Polski Południowej. Arch. Med. Sąd. Krym. 1999, 49, 149-152. -13. Takeshita H., Meyer E., Brinkmann B.: The STR loci HUMTPO and HumLPL: population genetic data in eight populations. Int. J. Legal Med. 1997, 110, 331-333.

Adres pierwszego autora:

Katedra Medycyny Sądowej Śląskiej AM

ul. Medyków 18

40-752 Katowice