• English
  • Polish



Zawartość


Agnieszka Maciejewska*, Regina Paszkowska*, Ryszard Pawłowski* **

Identyfikacja trzech rzadkich alleli: D21S11*24.2, D7S820*9.1 i HUMFGA*19.2 w populacji polskiej

Identification of three rare allele: D21S11*24.2, D7S820*9.1 and HUMFGA*19.2 in the Polish population

* Z Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej AM w Gdańsku

Kierownik: dr hab. Z. Szczerkowska - profesor AM

** Z Instytutu Ekspertyz Sądowych w Krakowie

Dyrektor: mgr A. Głazek

Praca przedstawia identyfikację w populacji polskiej trzech rzadkich alleli: D21S11*24.2, D7S820*9.1 i HUMFGA*19.2 nie obserwowanych dotychczas w Polsce. Warianty zidentyfikowano podczas rutynowych badań ponad 1600 próbek porównawczych. Praca prezentuje również obserwowane częstości alleli dla trzech w/w loci w dużych próbkach populacyjnych osobników z obszaru Polski.
This paper presents the identification of three rare alleles: D21S11*24.2, D7S820*9.1 and HUMFGA*19.2 not observed previously in a polish population. Allelic variants were identified during rutine analysis of more than 1600 reference samples. DNA extracts were amplified using ProfilerPlus kit or monoplex reactions. PCR products were separated using capillary electrophoresis with fluorescent detection. Population genetics data of D21S11, D7S820 and HUMFGA loci including minimal allele frequencies (pmin) in large population samples from Poland are also presented.
Słowa kluczowe: STR, rzadkie warianty, genetyka populacyjna, Polska północna
Key words: STR, rare variants, population genetics, North Poland

Wstęp
Od szeregu lat wiele loci typu STR znalazło szerokie zastosowanie w genetyce sądowej zarówno do badania spornego ojcostwa jak i identyfikacji śladów biologicznych. Szczególnie przydatne są te loci, które charakteryzują się wysoką siłą dyskryminacji, obecnością alleli o bardzo krótkich fragmentach oraz możliwością ich amplifikacji w reakcji kompleksowego PCR. Ta ostatnia cecha jest niezaprzeczalną zaletą szczególnie w przypadku pracy ze zdegradowanym materiałem biologicznym bądź znikomymi ilościami DNA. Od szeregu lat na rynku dostępne są komercyjne zestawy do kompleksowej amplifikacji wielu loci człowieka. Szereg z nich zostało poddanych szczegółowej weryfikacji w aspekcie ich przydatności do badań identyfikacyjnych (6,7,9). Zastosowanie wysoce rozdzielczych technik badania długości i sekwencji fragmentów DNA stworzyło możliwość precyzyjnej identyfikacji nie tylko powszechnie występujących alleli ale również rzadkich wariantów wykazujących polimorfizm długości lub sekwencji. Znajomość częstości alleli i genotypów jest nieodzowna przy statystycznym opiniowaniu przypadków z zakresu genetyki sądowej. Wysoce polimorficzne loci, takie jak mikrosatelity (STR) zawierają liczne allele a szereg z nich należy do rzadkich (5). Zgodnie z sugestiami Chakraborty’ego (4) za rzadki allel uważa się ten, który występuje w populacji z częstością poniżej 0.01. Niniejsza praca opisuje identyfikację, metodą wysocerozdzielczej techniki elektroforezy kapilarnej, trzech bardzo rzadkich alleli w zakresie loci D21S11, D7S820 i HUMFGA, które nie były dotychczas obserwowane w Polsce.
Materiały i metody
Badaniom poddano materiał biologiczny w postaci krwi lub wymazów z jamy ustnej pobranych jako materiał porównawczy od 2122 (HUMFGA), 1843 (D21S11) i 1622 (D7S820) osób obu płci pochodzących głównie z obszaru Polski północnej. DNA izolowano metodą Wieganda i wsp. po zastosowaniu niewielkich modyfikacji [ 10] . Ilość DNA oznaczano metodą fluorymetryczną (1,2) lub metodą hybrydyzacji z sondą swoistą dla DNA naczelnych (QuantiBlot, Perkin-Elmer, USA).
Amplifikację 10 loci zawartych w zestawie ProfilerPlus prowadzono zgodnie z zaleceniami producenta (Perkin-Elmer,USA). Amplifikację loci HUMFGA i D21S11 metodą monopleksowego PCR prowadzono jak opisano wcześniej (5,8). Reakcję PCR prowadzono stosując urządzenia do PCR firm Perkin-Elmer (ABI2400 i 877), Biometra (Trithermobloc i T-personal) oraz Polygen (PolyChainII).
Wielkości produktów PCR znakowanych fluorescencyjnie analizowano metodą elektroforezy kapilarnej na automatycznym sekwenatorze DNA ABI310 (Perkin-Elmer, USA). Produkty rozdzielano w kapilarze o długości 47 cm wypełnionej denaturującym nośnikiem POP4. Rozdział prowadzono przez 24 min. przy napięciu 15kV, 9mW i ok. 8mA. Jako standardu wewnętrznego wielkości DNA użyto markera ILS400 znakowanego CXR (Promega, USA) (9). Analizę wielkości fragmentów DNA przeprowadzono z zastosowaniem oprogramowania Gene Scan v.2.0. firmy Perkin-Elmer, USA. Allele dla loci powielanych metodą monopleks PCR określano porównując do sekwencjonowanych drabin alleli otrzymanych dzięki uprzejmości Prof. B. Brinkmann’a.
Wyniki i dyskusja
Badaniom poddano stosunkowo liczne próbki populacyjne: 1649, 1869 i 2122 odpowiednio w przypadku loci D7S820, D21S11 i HUMFGA.
Wśród 3244 alleli w locus D7S820 stwierdzono łącznie 11 alleli (Tabela I) i 34 z 66 możliwych genotypów oraz heterozygotyczność obserwowaną (H0bs) równą 0.7944.
Trzy z zaobserwowanych alleli w badanej populacji pojawiły się tylko raz. Są to allele: 6, 15 i nie obserwowany dotychczas w Polsce allel 9.1. Rycina 1 przedstawia elektroforegram prezentujący genotyp 9.1,12.
Ryc. 1. Elektroforegram prezentujący obecność allelu 9.1 w locus D7S820. Panel górny: rozdział drabiny alleli locus D7S820 metodą CE; Panel dolny: rozdział próbki o fenotypie 9.1,12.
Fig. 1. Electropherogram presenting the allele 9.1 in D7S820 locus. Upper panel: D7S820 allelic ladder. Lower panel: D7S820 genotype 9.1,12.
Wariant 9.1 nie jest obecny w drabinie alleli zestawu ProfilerPlus a zatem, że jest to ten właśnie wariant przemawia jego wielkość określona przy zastosowaniu standardu wewnętrznego w postaci ILS400, który umożliwia znacznie precyzyjniejsze określenie wielkości allelu (5,9) niż przy zastosowaniu GS500. W badanym przypadku wielkość nieznanego allelu była dokładnie o 11pz krótsza niż 12 allelu obecnego w tej samej próbce (Ryc. 1). Ustalenie, iż zidentyfikowano wariant potwierdzone zostało również analizą monopleksową w zakresie locus
Tabela I. Częstości alleli dla loci HUMFGA, D21S11 i D7S820 w populacji polskiej.
Table I. Allele frequencies of HUMFGA, D21S11 and D7S820 loci in the polish population.

Allele

HUMFGA (n=2122)

D21S11 (n=1843)

D7S820 (n=1622)

6

   

0.0003

7

   

0.0132

8

   

0.1511

9

   

0.1439

9.1

   

0.0003

10

   

0.2924

11

   

0.1980

12

   

0.1594

13

   

0.0292

14

   

0.0049

15

   

0.0003

16

0.0007

   

17

0.0025

   

18

0.0179

   

19

0.0867

   

19.2

0.0002

   

20

0.1524

   

20.2

0.0003

   

21

0.1870

   

21.2

0.0023

   

22

0.1889

   

22.2

0.0124

   

23

0.1185

   

23.2

0.0094

   

24

0.1237

   

24.2

0.0007

0.0003

 

25

0.0688

   

25.2

0.0007

0.0003

 

26

0.0216

0.0037

 

27

0.0030

0.0209

 

28

0.0011

0.1782

 

29

 

0.2089

 

29.2

 

0.0003

 

30

 

0.2190

 

30.2

 

0.0564

 

31

 

0.0695

 

31.2

 

0.0876

 

32

 

0.0111

 

32.2

 

0.1020

 

33

 

0.0027

 

33.1.2

 

0.0007

 

33.2

 

0.0364

 

34.2

 

0.0024

 
D7S820 po ponownej izolacji tej samej próbki. Jak wykazaliśmy uprzednio (9) zastosowanie standardu wewnętrznego w postaci ILS400 umożliwia znacznie precyzyjniejsze określenie wielkości fragmentu niż w przypadku zastosowania GS500 (wartości SD wynosiły 0.06-0.16pz dla analiz wykonanych na różnych kapilarach) i tym samym rozróżnienie nie tylko alleli różniących się o 2pz ale również o 1pz (ą3SD). Ostateczne potwierdzenie tego wariantu wymaga jednak zastosowania bezpośredniego sekwencjonowania produktu PCR. Obliczone częstości rzadkich alleli dla tego locus wynoszą 0.0003. Mając jednak na uwadze sugestie Chakraborty’ego (4) oraz Budowle i wsp. (3) przy obliczeniach częstości profili DNA zawierających rzadkie allele dla celów sądowych, należy posługiwać się wartością minimalnej częstości alleli (pmin), uwzględniającej nie tylko liczebność badanej populacji ale również wartość heterozygotyczności locus. Tak obliczone wartości dla tych trzech alleli winny więc wynosić 0.001312.
Dla 1843 próbek DNA badanych w zakresie locus D21S11 stwierdzono 17 alleli (Tab. I) i 77 genotypów z 153 możliwych oraz heterozygotyczność obserwowaną równą 0.8550. Wśród 3686 alleli stwierdzono 7 rzadkich (Tab. I). Cztery z zaobserwowanych 17 alleli pojawiły się tylko raz. Są to: 33.1.2 (5), 29.2, 25.2 i nie obserwowany dotychczas w Polsce allel 24.2.
Rycina 2 przedstawia elektroforegram genotypu 24.2, 29. Allel 24.2 jest w pełni zgodny co do ruchliwości elektroforetycznej z obecnym w drabinie alleli ProfilerPlus sekwencjonowanym standardem 24.2.
Ryc. 2. Elektroforegram prezentujący obecność allelu 24.2 w locus D21S11. Panel górny: rozdział drabiny alleli locus D21S11 metodą CE; Panel dolny: rozdział próbki o fenotypie 24.2, 29.
Fig. 2. Electropherogram presenting the allele 9.1 in D21S11locus. Upper panel: D21S11 allelic ladder. Lower panel: genotype 24.2, 29 in locus D21S11.
Analogicznie, jak w przypadku locus D7S820 obliczono wartość pmin , która dla próbki liczącej 1843 alleli i obserwowanej heterozygotyczności równej 0.8550 wynosi 0,001270.
Trzeci nie obserwowany dotychczas w Polsce allel stwierdzono w zakresie locus HUMFGA. W badanej populacji 2122 osób zaobserwowano łącznie 20 alleli (Tabela I) oraz 91 genotypów z 210 możliwych. Obliczona wartość heterozygotyczności obserwowanej wyniosła 0.8523. W analizowanej populacji allel 19.2 pojawił się tylko raz i nie był obserwowany dotychczas w Polsce. Ponadto zaobserwowano 9 rzadkich alleli: 16, 17, 20.2, 21.2, 23.2, 24.2, 25.2, 27 i 28 (Tab. I). Rycina 3 przedstawia elektroforegram prezentujący genotyp 19.2, 25.
Ryc. 3. Elektroforegram prezentujący obecność allelu 19.2 w locus HUMFGA. Panel górny: rozdział drabiny alleli locus HUMFGA metodą CE; Panel dolny: rozdział próbki o fenotypie 24.2, 29.
Fig. 3. Electropherogram presenting allele 19.2 in HUMFGA locus. Upper panel: HUMFGA allelic ladder. Lower panel: genotype 19.2, 25 in locus HUMFGA.
Porównanie wielkości allela 19.2 z obecnymi w drabinie alleli Profilera, allelami 19 i 20 wykazało, iż jego wielkość dokładnie odpowiada allelowi pośredniemu 19.2.
Obliczona wartość pmin , dla 4244 alleli i H obs = 0.8523 wynosi 0,001113. Wartość ta jest niższa niż w przypadku pmin dla D21S11 głównie ze względu na fakt liczniejszej o prawie 400 osobników populacji. Zgodnie z zależnościami podanymi przez Chakraborty’ego przy tej samej liczebności badanych prób niższa wartość pmin charakteryzuje loci o mniejszej heterozygotyczności obserwowanej (3, 4).
Piśmiennictwo
1. Bontemps I., Houssier C., Frederig E.: Physico-chemical study of the complex of "33258 Hoechst" with DNA and nucleohistone. Nucleic Acids Res., 1975, 2: 971-984.- 2. Brunk C. F., Jones K. D. James T. W.: Assay for nanogram quantities of DNA in cellular homogenates. Anal. Bioch. 1979, 92: 497-500. - 3. Budowle B., Monson K.L., Chakraborty. R.: Estimating minimum allele frequencies for DNA profile frequency estimates for PCR-based loci. Int-J-Legal-Med. 1996, 108(4), 173-6. - 4. Chakraborty R.: Sample size requirements for addressing the population genetic issues of forensic use of DNA typing. Hum-Biol. 1992, 64(2), 141-59. - 5. Dettlaff-Kąkol A., Pawłowski R.: Additional variability at the D21S11 locus: sequencing evidence of a new allele D21S11*33.1, Z Zagad. Nauk sądowych 2001, XLVII, 314-322. - 6. Frank W.E., Llewellyn B.E., Fish P.A., Riech A.K., Marcacci T.L., Gandor D.W., Parker D., Carter R.R., Thibault S.M.: Validation of the AmpFlSTR Profiler Plus PCR amplification kit for use in forensic casework.. J-Forensic-Sci. 2001, 46(3), 642-46. - 7. Holt C.L., Buoncristiani M., Wallin J.M., Nguyen T., Lazaruk,K.D., Walsh, P.S.: TWGDAM validation of AmpFlSTR PCR amplification kits for forensic DNA casework. J-Forensic-Sci. 2002, 47(1), 66-96. - 8. Pawłowski R.: HUMFIBRA allele distribution in the Northern Poland using capillary electrophoresis. Int J Legal Med. 1999, 112, 139-141. - 9. Pawlowski R., Maciejewska A.: Forensic validation of a multiplex containing nine STRs-population genetics in northern Poland. Int-J-Legal-Med. 2000, 114 (1-2), 45-49. - 10. Wiegand P., Schuerenkamp M., Schuette U.: DNA extraction from mixtures of body fluid using mild preferential lysis. Int. J Leg Med., 1992, 104, 359-360.
 
Adres pierwszego autora:
Katedra i Zakład Medycyny Sądowej
ul. Dębinki 7
80-211 Gdańsk
 
 
designed by PixelThemes.com