Agnieszka Maciejewska*, Regina Paszkowska*, Ryszard Pawłowski* **
Identyfikacja trzech rzadkich alleli: D21S11*24.2, D7S820*9.1 i HUMFGA*19.2 w populacji polskiej
Identification of three rare allele: D21S11*24.2, D7S820*9.1 and HUMFGA*19.2 in the Polish population
* Z Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej AM w Gdańsku
Kierownik: dr hab. Z. Szczerkowska - profesor AM
** Z Instytutu Ekspertyz Sądowych w Krakowie
Dyrektor: mgr A. Głazek
Praca przedstawia identyfikację w populacji polskiej trzech rzadkich alleli: D21S11*24.2, D7S820*9.1 i HUMFGA*19.2 nie obserwowanych dotychczas w Polsce. Warianty zidentyfikowano podczas rutynowych badań ponad 1600 próbek porównawczych. Praca prezentuje również obserwowane częstości alleli dla trzech w/w loci w dużych próbkach populacyjnych osobników z obszaru Polski.
This paper presents the identification of three rare alleles: D21S11*24.2, D7S820*9.1 and HUMFGA*19.2 not observed previously in a polish population. Allelic variants were identified during rutine analysis of more than 1600 reference samples. DNA extracts were amplified using ProfilerPlus kit or monoplex reactions. PCR products were separated using capillary electrophoresis with fluorescent detection. Population genetics data of D21S11, D7S820 and HUMFGA loci including minimal allele frequencies (pmin) in large population samples from Poland are also presented.
Słowa kluczowe: STR, rzadkie warianty, genetyka populacyjna, Polska północna
Key words: STR, rare variants, population genetics, North Poland
Wstęp
Od szeregu lat wiele loci typu STR znalazło szerokie zastosowanie w genetyce sądowej zarówno do badania spornego ojcostwa jak i identyfikacji śladów biologicznych. Szczególnie przydatne są te loci, które charakteryzują się wysoką siłą dyskryminacji, obecnością alleli o bardzo krótkich fragmentach oraz możliwością ich amplifikacji w reakcji kompleksowego PCR. Ta ostatnia cecha jest niezaprzeczalną zaletą szczególnie w przypadku pracy ze zdegradowanym materiałem biologicznym bądź znikomymi ilościami DNA. Od szeregu lat na rynku dostępne są komercyjne zestawy do kompleksowej amplifikacji wielu loci człowieka. Szereg z nich zostało poddanych szczegółowej weryfikacji w aspekcie ich przydatności do badań identyfikacyjnych (6,7,9). Zastosowanie wysoce rozdzielczych technik badania długości i sekwencji fragmentów DNA stworzyło możliwość precyzyjnej identyfikacji nie tylko powszechnie występujących alleli ale również rzadkich wariantów wykazujących polimorfizm długości lub sekwencji. Znajomość częstości alleli i genotypów jest nieodzowna przy statystycznym opiniowaniu przypadków z zakresu genetyki sądowej. Wysoce polimorficzne loci, takie jak mikrosatelity (STR) zawierają liczne allele a szereg z nich należy do rzadkich (5). Zgodnie z sugestiami Chakraborty’ego (4) za rzadki allel uważa się ten, który występuje w populacji z częstością poniżej 0.01. Niniejsza praca opisuje identyfikację, metodą wysocerozdzielczej techniki elektroforezy kapilarnej, trzech bardzo rzadkich alleli w zakresie loci D21S11, D7S820 i HUMFGA, które nie były dotychczas obserwowane w Polsce.
Materiały i metody
Badaniom poddano materiał biologiczny w postaci krwi lub wymazów z jamy ustnej pobranych jako materiał porównawczy od 2122 (HUMFGA), 1843 (D21S11) i 1622 (D7S820) osób obu płci pochodzących głównie z obszaru Polski północnej. DNA izolowano metodą Wieganda i wsp. po zastosowaniu niewielkich modyfikacji [ 10] . Ilość DNA oznaczano metodą fluorymetryczną (1,2) lub metodą hybrydyzacji z sondą swoistą dla DNA naczelnych (QuantiBlot, Perkin-Elmer, USA).
Amplifikację 10 loci zawartych w zestawie ProfilerPlus prowadzono zgodnie z zaleceniami producenta (Perkin-Elmer,USA). Amplifikację loci HUMFGA i D21S11 metodą monopleksowego PCR prowadzono jak opisano wcześniej (5,8). Reakcję PCR prowadzono stosując urządzenia do PCR firm Perkin-Elmer (ABI2400 i 877), Biometra (Trithermobloc i T-personal) oraz Polygen (PolyChainII).
Wielkości produktów PCR znakowanych fluorescencyjnie analizowano metodą elektroforezy kapilarnej na automatycznym sekwenatorze DNA ABI310 (Perkin-Elmer, USA). Produkty rozdzielano w kapilarze o długości 47 cm wypełnionej denaturującym nośnikiem POP4. Rozdział prowadzono przez 24 min. przy napięciu 15kV, 9mW i ok. 8mA. Jako standardu wewnętrznego wielkości DNA użyto markera ILS400 znakowanego CXR (Promega, USA) (9). Analizę wielkości fragmentów DNA przeprowadzono z zastosowaniem oprogramowania Gene Scan v.2.0. firmy Perkin-Elmer, USA. Allele dla loci powielanych metodą monopleks PCR określano porównując do sekwencjonowanych drabin alleli otrzymanych dzięki uprzejmości Prof. B. Brinkmann’a.
Wyniki i dyskusja
Badaniom poddano stosunkowo liczne próbki populacyjne: 1649, 1869 i 2122 odpowiednio w przypadku loci D7S820, D21S11 i HUMFGA.
Wśród 3244 alleli w locus D7S820 stwierdzono łącznie 11 alleli (Tabela I) i 34 z 66 możliwych genotypów oraz heterozygotyczność obserwowaną (H0bs) równą 0.7944.
Trzy z zaobserwowanych alleli w badanej populacji pojawiły się tylko raz. Są to allele: 6, 15 i nie obserwowany dotychczas w Polsce allel 9.1. Rycina 1 przedstawia elektroforegram prezentujący genotyp 9.1,12.
Ryc. 1. Elektroforegram prezentujący obecność allelu 9.1 w locus D7S820. Panel górny: rozdział drabiny alleli locus D7S820 metodą CE; Panel dolny: rozdział próbki o fenotypie 9.1,12.
Fig. 1. Electropherogram presenting the allele 9.1 in D7S820 locus. Upper panel: D7S820 allelic ladder. Lower panel: D7S820 genotype 9.1,12.
Wariant 9.1 nie jest obecny w drabinie alleli zestawu ProfilerPlus a zatem, że jest to ten właśnie wariant przemawia jego wielkość określona przy zastosowaniu standardu wewnętrznego w postaci ILS400, który umożliwia znacznie precyzyjniejsze określenie wielkości allelu (5,9) niż przy zastosowaniu GS500. W badanym przypadku wielkość nieznanego allelu była dokładnie o 11pz krótsza niż 12 allelu obecnego w tej samej próbce (Ryc. 1). Ustalenie, iż zidentyfikowano wariant potwierdzone zostało również analizą monopleksową w zakresie locus
Tabela I. Częstości alleli dla loci HUMFGA, D21S11 i D7S820 w populacji polskiej.
Table I. Allele frequencies of HUMFGA, D21S11 and D7S820 loci in the polish population.
Allele |
HUMFGA (n=2122) |
D21S11 (n=1843) |
D7S820 (n=1622) |
6 |
0.0003 |
||
7 |
0.0132 |
||
8 |
0.1511 |
||
9 |
0.1439 |
||
9.1 |
0.0003 |
||
10 |
0.2924 |
||
11 |
0.1980 |
||
12 |
0.1594 |
||
13 |
0.0292 |
||
14 |
0.0049 |
||
15 |
0.0003 |
||
16 |
0.0007 |
||
17 |
0.0025 |
||
18 |
0.0179 |
||
19 |
0.0867 |
||
19.2 |
0.0002 |
||
20 |
0.1524 |
||
20.2 |
0.0003 |
||
21 |
0.1870 |
||
21.2 |
0.0023 |
||
22 |
0.1889 |
||
22.2 |
0.0124 |
||
23 |
0.1185 |
||
23.2 |
0.0094 |
||
24 |
0.1237 |
||
24.2 |
0.0007 |
0.0003 |
|
25 |
0.0688 |
||
25.2 |
0.0007 |
0.0003 |
|
26 |
0.0216 |
0.0037 |
|
27 |
0.0030 |
0.0209 |
|
28 |
0.0011 |
0.1782 |
|
29 |
0.2089 |
||
29.2 |
0.0003 |
||
30 |
0.2190 |
||
30.2 |
0.0564 |
||
31 |
0.0695 |
||
31.2 |
0.0876 |
||
32 |
0.0111 |
||
32.2 |
0.1020 |
||
33 |
0.0027 |
||
33.1.2 |
0.0007 |
||
33.2 |
0.0364 |
||
34.2 |
0.0024 |