R. Pawłowski* **, A. Dettlaff-Kąkol*, A. Maciejewska*, R. Paszkowska*, M. Reichert*, G. Jezierski*
Genetyka populacyjna 9 loci typu Y-STR w populacji Polski Północnej
Population Genetics of 9 Y-chromosome STR Loci in Northern Poland
* Z Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej AM w Gdańsku
Kierownik: dr hab. Z. Szczerkowska - profesor AM
** Z Instytutu Ekspertyz Sądowych w Krakowie
Dyrektor: A. Głazek
Badaniom poddano DNA pochodzący od 508 mężczyzn w zakresie 9 loci typu STR z chromosomu Y (DYS 19, DYS 390, DYS 393, DYS 392, DYS 391, DYS 389I, DYS 389II i DYS 385I/II). Amplifikację prowadzono stosując dwie reakcje typu kompleksowego PCR. W badanej próbce zidentyfikowano 328 różnych haplotypów, z których 264 pojawiło się tylko raz. Najczęściej obserwowany w populacji polskiej haplotyp występuje z częstością 4.6% i tym samym pojawia się prawie 15 razy częściej w naszej populacji niż w skumulowanej populacji Europy (bez Polski). Obliczony współczynnik dyskryminacji dla wszystkich 9 loci wyniósł 0,9943. W badanej populacji zidentyfikowano trzy mutacje typu insercyjnego. W locus DYS19 stwierdzono duplikację a w zakresie loci DYS385I/II dwie triplikacje.
A total of 508 unrelated males from the North Poland population were analyzed for 9 Y-chromosome STRs (DYS 19, DYS 390, DYS 393, DYS 392, DYS 391, DYS 389I, DYS 389II and DYS 385I/II) using two multiplex reactions and detection of PCR products using capillary electrophoresis. In the analyzed sample 328 different haplotypes were identified, among which 264 were unique. It was found that the model for a Polish population haplotype (DYS 19*17, DYS 390*25, DYS 393*13, DYS 392*11, DYS 391*10, DYS 389I*13, DYS 389II*30, DYS 385I/II*10,14) is almost 15 times more frequent in our population than in a cumulative European one. The haplotype diversity/discrimination index calculated for 9 loci is 0,9943. In the analysed population sample three mutations were detected in the DYS19 (duplication) and DYS385I/II loci (triplications).
Słowa kluczowe: loci Y-STR, kompleksowy PCR, badania populacyjne, polimorfizm insercyjny, haplotypy.
Key words: Y-STR loci, multiplex PCR, population studies, insertion polymorhpism, haplotypes.
Wstęp
W ostatnich latach do praktyki medyczno-sądowej w zakresie identyfikacji śladów biologicznych i dochodzenia spornego ojcostwa wprowadzono szereg polimorficznych loci z chromosomu Y (5,9,11). Ponieważ loci typu Y-STR są zlokalizowane w nie-pseudoautosomalnym regionie chromosomu Y, są specyficzne dla mężczyzny, mają charakter haploidalny i nie podlegają rekombinacji dlatego używane są jako model mutacji STR u człowieka (3, 7, 8). Pod pewnymi względami polimorficzne loci z chromosomu Y przypominają dziedziczony w linii żeńskiej DNA mitochondrialny znajdując zastosowanie w wielu dziedzinach genetyki człowieka a w szczególności w badaniach historii i ewolucji populacji ludzkich. Ze względu na wyłącznie męski charakter dziedziczenia ważną aplikacją loci Y-STR stało się ich zastosowanie w genetyce sądowej do selektywnego identyfikowania DNA mężczyzn szczególnie w wymazach z dróg rodnych zawierających mieszaniny DNA kobiety i mężczyzny.
Celem niniejszego opracowania była analiza 9 loci Y-STRs w populacji mężczyzn z Polski północnej w celu zbudowania bazy danych haplotypów.
Materiały i Metody
1. Ekstrakcja DNA
Próbki krwi lub wymazy zawierające nabłonki z jamy ustnej pochodziły od 508 niespokrewnionych mężczyzn zamieszkujących Polskę północną. DNA izolowano stosując zestaw "Sherlock AX" (A@A Biotechnology, Gdańsk) a ilość DNA oznaczano metodą fluorymetryczną.
2. Warunki amplifikacji
Zestaw 9 loci Y-STR amplifikowano w dwóch oddzielnych reakcjach typu kompleksowego PCR: DYSI zawierającym loci DYS19, DYS390, DYS393, oraz amelogeniny i DYSII zawierającym loci DYS391, DYS392, DYS389I/II, DYS385I/II stosując metody opracowane w naszym laboratorium (2). Dla wszystkich badanych loci z wyjątkiem DYS385I/II i amelogeniny stosowano startery podane przez Kaysera i wsp. (5). W przypadku loci DYS385I/II i amelogeniny używano starterów opisanych przez Schneidera i wsp. (12) i Sullivana i wsp. (13). Startery dla loci: DYS391, DYS392 i DYS393 wyznakowano fluorescencyjnym znacznikiem HEX, dla DYS 19, amelogeniny i DYS389I/II - 6-FAM, a dla DYS390 i DYS385I/II - TET.
Reakcje kompleksowego PCR prowadzono w objętości 15 m L, a mieszaniny zawierały: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1,5 mM MgCl2, 200 m M dNTP, 0,3 U polimerazy AmpliTaq Gold (Perkin Elmer) i 1,5-3 ng matrycowego DNA. Używano następujących stężeń starterów DYSI: amelogenina - 0.06 m M, DYS19 - 0.24 m M, DYS390 - 0.08 m M, DYS393 - 0.15 m M a w przypadku drugiej reakcji kompleksowej DYSII: DYS393 - 0.3 m M, DYS392 - 0.3 m M, DYS385I/II - 0.25 i DYS389I/II - 0.23 m M. Obie reakcje prowadzono w tych samych warunkach przy uzyciu termocyklera ABI2400 f-my Perkin Elmer (95° C/11 min, a następnie 30 cykli przy 95° C/1 min, 55° C/1,5 min i 72° C/2 min i ostatecznie wydłużano w 60° C przez 30 min).
3. Detekcja produktów PCR
1m L każdego z produktów kompleksowego PCR (DYSI i DYSII) mieszano z 12 m L dejonizowanego formamidu (Amresco) i 0,5 m L standardu wewnętrznego GS500. Mieszaninę denaturowano a następnie analizowano stosując aparat ABI310 (Perkin-Elmer). Poszczególne allele oznaczano stosując nomenklaturę opartą na ilości jednostek repetytywnych zgodnie z rekomendacjami International Society of Forensic Genetics (4). Drabiny alleli otrzymano dzięki uprzejmości Prof. B. Brinkmanna (Muenster), Prof P. deKnijffa (Leiden) i Prof P. Schneidera (Mainz). Analizę danych prowadzono stosując program GeneScan v. 2.1.
4. Analiza statystyczna.
Różnorodność genową i haplotypów obliczano stosując następujące wzory: D = 1-S Pi2, HD = (n/n-1) (1-S Pi2), gdzie Pi to częstość poszczególnych alleli.
Wyniki i dyskusja
Analizę polimorfizmu 9 loci typu Y-STR DYS19, DYS390, DYS393, DYS392, DYS391, DYS389I, DYS389II i DYS385I/II przeprowadzono w celu zbudowania odpowiedniej bazy danych. Zaobserwowane częstości alleli i haplotypów przedstawia Tabela I.
Zestawienie zawiera również obliczone wartości różnorodności genowej, która jest w tym przypadku równoważna mocy dyskryminacyjnej i szansie wykluczenia. Najbardziej dyskryminującym markerem okazał się kompleks loci DYS385I/II dając w analizowanej próbce 45 różnych haplotypów. Najczęstszym genotypem w naszej populacji jest 11,14 (częstość 33,7%), który jest typową parą alleli w Europie (11). Współczynniki różnorodności genowej dla badanych loci zmniejszają się w następującej kolejności: DYS385I/II, DYS19, DYS389II, DYS390, DYS391, DYS389I, DYS392 and DYS393. Najmniej informatywnym lokus okazał się DYS 393. Zaobserwowano w nim 7 alleli ale z powodu ewidentnej dominacji allelu 13 (80%) zaobserwowany współczynnik dyskryminacji był bardzo niski.
Tabela II zawiera częstości haplotypów dla całego zestawu badanych loci.
W 508 próbkach DNA, stwierdzono 328 różnych haplotypów, wśród których 264 obserwowano tylko raz a 31 obserwowano tylko dwa razy. Najczęstszy haplotyp (DYS 19*17, DYS 390*25, DYS 393*13, DYS 392*11, DYS 391*10, DYS 389I*13, DYS 389II*30, DYS 385I/II*10,14) stwierdzono u 22 mężczyzn (częstość 4,3%). Drugi co do częstości haplotyp (DYS 19*16, DYS 390*25, DYS 393*13, DYS 392*11, DYS 391*10, DYS 389I*13, DYS 389II*29, DYS 385I/II*11,14) obecny jest w naszej populacji u 3.3% mężczyzn. W tabeli III porównano częstości występowania najczęstszego haplotypu w naszej populacji z najczęstszym obecnym w skumulowanej populacji europejskiej.
Tabela I. Częstości alleli i haplotypów oraz różnorodność genowa dla 9 loci typu Y-STR (N=508).
Table I. Allele and haplotype frequencies and gene diversity obtained for the nine Y-STR loci studied (N=508)
Ciąg dalszy tabeli I.
Zestawienie powyższych danych wykazuje, iż najczęstszy haplotyp naszej populacji, w pozostałych populacjach Europy występuje blisko 15 razy rzadziej. W tej sytuacji można mówić o jego "specyficzności" dla naszej populacji. Dla tej kalkulacji, 995 haplotypów z Polski skumulowano (508 przedstawionych w tej pracy oraz 487 z obszaru Krakowa, Warszawy, Wrocławia i Bydgoszczy) i porównano z 7752 haplotypami z różnych populacji europejskich lecz bez Polski. Częstości haplotypów pobrano ze strony internetowej http://ystr.charite.de.
Kombinacja 9 loci typu Y-STR daje współczynnik różnorodności haplotypów równy 0,9943. Tak wysoka moc dyskryminacyjna tych loci wskazuje na ich wysoką przydatność do badań identyfikacyjnych w genetyce sądowej. Została ona z powodzeniem zweryfikowana podczas pierwszego w Polsce "polowania na przestępcę" z użyciem DNA (2).
Tabela II. Częstości haplotypów 9 loci typu Y-STR (DYS 19, DYS 390, DYS 393, DYS 392, DYS 391, DYS 389I, DYS 389II and DYS 385I/II) w populacji Polski Północnej (N=508).
Table II. The frequencies of haplotypes of 9 loci Y-STR type (DYS 19, DYS 390, DYS 393, DYS 392, DYS 391, DYS 389I, DYS 389II and DYS 385I/II) in the North Polish population (N=508).
Ciąg dalszy tabeli II.
Ciąg dalszy tabeli II.
Ciąg dalszy tabeli II.
Ciąg dalszy tabeli II.
Ciąg dalszy tabeli II.
Ciąg dalszy tabeli II.
Ciąg dalszy tabeli II.
Ciąg dalszy tabeli II.
Tabela III. Porównanie frekwencji najczęstszego w Polsce haplotypu z jego częstością w Europie.
Table III. Frequency of the most frequent Polish haplotype in the European population
System(s) DYS 19 DYS 390 DYS 393 DYS 392 DYS 391 DYS 389I DYS 389II DYS 385I/II 17 25 13 11 10 13 30 10,14 Częstość w populacji polskiej (n = 995) - 4,6% Frequency in the Polish population (n = 995) - 4,6% Częstość w skumulowanej populacji europejskiej oprócz Polski (n = 7752) - 0,31% Frequency in a cumulative European population except Polish (n = 7752) - 0,31%
|
W badanej populacji zaobserwowaliśmy również trzy mutacje. Podczas rutynowej analizy próbek porównawczych stwierdzono profile DNA zawierające dodatkowe allele będące wynikiem polimorfizmu insercyjnego. Mutacje te obserwowano w loci DYS 19 (allele 16,17) i DYS 385I/II (allele 11,12,13 oraz 13,14,15). Rycina 1 przedstawia przykłady tych mutacji - duplikację w locus DYS19 i triplikację w locus DYS385I/II.
Ryc. 1. Dodatkowe allele jako efekt polimorfizmu insercyjnego na chromosomie Y. Panel górny triplikacja w locus DYS385I/II (allele 13,14,15). Panel dolny duplikacja w locus DYS19 (allele 16,17).
Fig. 1. Additional alleles as a result of Y-chromosomal insertion polymorphism. Upper panel triplication in a DYS385I/II loci (alleles 13,14,15), bottom panel duplication in a DYS19 locus (alleles 16,17).
Tabela IV przedstawia porównanie częstości polimorfizmu insercyjnego pomiędzy populacją Polską a innymi populacjami europejskimi (6).
Tabela IV. Częstość polimorfizmu insercyjnego w populacji 508 mężczyzn z północnej Polski
Table IV. Frequency of insertion polymorphism in the population sample of 508 males from North Poland
Locus Obserwowana ilość Częstość (%) Częstość % obs. (n = 7772) (11) Locus No observed Frequency (%) Frequency % obs. (n = 7772) (11) |
DYS 19 1/508 0.197 0.12 DYS 390 0/508 0 0 DYS 391 0/508 0 0 DYS 392 0/508 0 0 DYS 393 0/508 0 0 DYS 385I/II 2/508 0.394 0.2 DYS 389I 0/508 0 0 DYS 389II 0/508 0 0 |