Zofia Szczerkowska, Ewa Kapińska, Joanna Wysocka, Grzegorz Jezierski

Rzadki wariant STR Locus HumCSF1PO

Rare variant of STR locus HumCSF1PO

Z Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej AM w Gdańsku

Kierownik: dr hab. Z. Szczerkowska - profesor AM

Mikrosatelitarny układ CSF1PO (Human c-fms proto-oncogene for CSF-1 receptor gene) należy do dobrze poznanych markerów genetycznych wykorzystywanych w medycynie sądowej. Jego locus znajduje się w intronowej części chromosomu 5 (5q 33.3-34). Allele systemu CSF1PO zawierają 9 fragmentów obejmujących kolejno od 7 do 15 repetytyw-nych powtórzeń (TCTA). W czasie badań w sprawie spornego ojcostwa w Katedrze i Zakładzie Medycyny Sądowej AMG w omawianym locus ujawniono dodatkowy, bardzo rzadki allel niewystępujący w komercyjnych wzorcach. Poddano go sekwencjonowaniu. Wykazano obecność jednostki repetytywnej charakterystycznej dla CSF1PO pojawiającej się w 16 powtórzeniach (TCTA)16.

This paper reports the sequences of allele 16 identified at the HumCSF1PO (Human c-fms proto-oncogene for CSF-1 receptor gene) microsatellite (STR) locus (5q 33.3-34). During routine practice at the Department of Forensic Medicine, Medical University of Gdansk, in a case of paternity testing, a very rare allele, not appearing in commercial ladders characteristic of CSF1PO were detected in 16 repetitive units (TCTA)16.

Słowa kluczowe: PCR-STR, CSF1PO, rzadki allel

Key words: PCR-STR, CSF1PO, rare allele

Wysoce polimorficzne sekwencje ludzkiego DNA typu STR (short tandem repeats) określane metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), stanowią podstawowe narzędzie badawcze wykorzystywane w analizie spornego ojcostwa i identyfikacji śladów biologicznych. Charakteryzują się one zmienną liczbą krótkich tandemowych powtórzeń, z jednostką repetytywną 2-6 pz. Do dobrze poznanych i opracowanych metodycznie mikrosatelitarnych układów należą m.in. allele locus HumCSF1PO. Ich czteronukleotydowe powtórzenia zlokalizowane są na chromosomie 5 (5q33.3-34) (2). Produkty amplifikacji w/w systemu ocenia się względem markera wielkości (allelic ladder). Wzorzec alleli systemu CSF1PO składa się z 9 fragmentów DNA o długości od 295-327 pz obejmujących kolejno od 7 do 15 repetytywnych powtórzeń (AGAT) (3).

W czasie badań w sprawach spornego ojcostwa przeprowadzonych w Katedrze i Zakładzie Medycyny Sądowej Akademii Medycznej w Gdańsku w locus HumCSF1PO ujawniono dodatkowy, bardzo rzadki allel niewystępujący w komercyjnych wzorcach (4).

W celu dokładnego zbadania zidentyfikowanego wariantu fragmenty DNA poddano procedurze przygotowującej go do sekwencjonowania (7).

MATERIAŁ I METODY

1. Amplifikacja DNA

1-3 ng genomowego DNA amplifikowano przy użyciu termocyclera Mestercycler Gradient f-my Zeiss stosując primery f-my Integrated DNA Technology o przedstawionych niżej sekwencjach: (6, 9)

CSF 1PO forward

5'-AAC CTG AGT CTG CCA AGG ACT AGC-3'

CSF 1PO reverse

5'-TTC CAC ACA CCA ATG GCC ATC TTC-3'.

Reakcja PCR przebiegała w następujących warunkach:

wstępna denaturacja 96°C/2 min.

I faza: 10 cykli II faza: 20 cykli

denaturacja 94°C/1 min. 90°C/1 min.

hybrydyzacja 64°C/1 min. 64°C/1 min.

elongacja 70°C/1,5 min. 70°C/1,5 min.

Zamplifikowane produkty PCR locus HumCSF1PO zawierające fenotyp 12/16 poddano elektroforezie na 6% pionowych żelach denaturujących (Gene Page Plus 6% f-my Amresco). Elektroforezę prowadzono w aparacie S.A. 32 (f-ma Life Technologies Inc.) w czasie 2 godz. przy 2500V, 40W i 40 mA. Do detekcji alleli zastosowano metodę barwienia z azotanem srebra (1, 8) z niewielkimi własnymi modyfikacjami. Z żelu wycięto frakcję odpowiadającą 16 allelowi i rozpuszczano w 50 ľl wody HPLC, w temp. 56°C. 3 ľl ekstraktu użyto do ponownej amplifikacji locus HumCSF1PO. Produkty PCR oczyszczano na kolumienkach Microcon - 100, do których dodawano po 30 ľl produktu PCR i 450 ľl wody. Po zwirowaniu przesącz odrzucano, a do supernatantu dodawano 450 ľl wody i ponownie wirowano w tych samych warunkach. Następnie kolumienki odwracano, umieszczano w nowych jałowych probówkach i wirowano. Tak oczyszczony produkt poddano reakcji sekwencjonowania. Na rycinie 1 przedstawiono obraz elektroforetyczny układu CSF1PO po wycięciu allela 16, a na rycinie 2, produkt amplifikacji allela 16 systemu CSF1PO.

Ryc. 1. Obraz elektroforetyczny żelu po wycięciu allela 16 systemu CSF1PO

Fig. 1. Electrophoretic pattern of the gel after the excision of unknown allele of the CSF1PO system

Ryc. 2. Produkt amplifikacji allela 16 systemu CSF1PO

Fig. 2. Product of the amplification of unknown allele

2. Reakcja sekwencjonowania:

Reakcję sekwencjonowania przeprowadzano przy użyciu zestawu ABI Prism BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applera, USA) (7). Produkt PCR sekwencjonowano w obu kierunkach w 20 ľl mieszaniny reakcyjnej, w obecności 3,2 pmola tego samego startera, który użyty był do reakcji PCR. Reakcję sekwencjonowania przeprowadzano w 0,2 ml probówkach typu MicroAmp (PE) z wykorzystaniem termocyclera Gene Amp PCR 2400 (PE), w następujących warunkach:

wstępna denaturacja: 96°C/11 sek.

25 cykli: 96°C/10 sek.; 50°C/5 sek; 60°C/4 min.

Produkty sekwencjonowania oczyszczano przez precypitację 95% etanolem w obecności octanu sodu. Po 30 min precypitacji w temperaturze pokojowej próbki wirowano przy 14 tys. rpm przez 20 min Usuwano supernatant, a produkty przemywano 70% etanolem. Po zworteksowaniu i zwirowaniu etanol usuwano, a produkt suszono w 90°C przez 1 min.

3. Rozdział produktów reakcji sekwencjonowania metodą elektrofo-rezy kapilarnej

Do wysuszonego produktu reakcji sekwencjonowania dodawano 20 ľl dejonizowanego formamidu. Następnie próbki denaturowano w temperaturze 95°C przez 3 min i natychmiast umieszczano w lodzie. Tak przygotowany produkt rozdzielano metodą elektroforezy kapilarnej na sekwenatorze ABI Prism 310, w kapilarze 50 ľm x 47 cm wypełnionej denaturującym polimerem POP6, przy nastrzyku 2,0 kV przez 45 s i późniejszym rozdziale przez 20 min przy 15 kV. Do analizy uzyskanych wyników zastosowano program komputerowy Sequence Analysis v.3.4.1. (Applera, USA).

WYNIKI I DYSKUSJA

W wyniku przeprowadzonych badań uzyskano sekwencję dla jednej nici omawianego allela systemu CSF1PO. Przestawiono ją na rycinie 3.

Ryc. 3. Sekwencja 16 allela locus HumCSF1PO

Fig. 3. Sequence of allele 16 of locus HUMCSF1PO

Analiza sekwencji allela wykazała obecność następującej jednostki repetytyw-nej:

(TCTA)16 charakterystycznej dla locus HumCSF1PO. Sekwencja regionu flankującego (ang. flanking region) jest zgodna z tą, którą podano w Gene Bank.

PIŚMIENNICTWO

1. Allen R., Graves G., Budowle B. (1989): Polymerase chain reaction amplification products separated on the hydratable polyacrylamide gels and stained with silver, Biotechniques 7, 736-744. - 2. Budowle B., Koons B.W., Keys K.M., Smerick J.B: Methods for typing the STR Triplex CSF1PO, TPOX and HUMTH01 That Enable Compatibility Among DNA Typing Laboratories. Forens. Sc. Resear. Unit, Laboratory Division, FBI. - 3. Crouse C.A, Rogers S., Aniott E., Gibson S., Masibay A. (1999): Analysis and Interpretation of Short Tandem Repeat Microvariants and Three - Banded Allele Petterns Using Multiple Allel Detection System. J. Forens. Sc. 44 (1), 87-94. - 4. Gene M., Carracedo A, Huguet E., Perez-Perez A., Moreno P. (1998): Population genetics of the D12S391, CSF1PO and TPOX loci in Catalonia (Noortheast Spain). Int. J. Leg. Med. 111, 52-54. - 5. Hochmeister M.N., Budowle B., Schumn J.W., Sprecher C.J., Borer U.V., Dirnhofer R. (1995): Swiss population data and forensic efficiency values on 3 tetrameric short repeat loci - HumTH01, TPOX and CSF1PO - derived using a STR multiplex system. Int. J. Leg. Med. 107, 246-249. - 6. Huang N.E., Schumn J., Budowle B. (1995): Chinese population data on three tetrameric short tandem repeat loci - HumTH01, TPOX, and CSF1PO - derived using multiplex PCR and manual typing Forens. Sc. Int. 71, 131-136. - 7. Protocol - Applied Biosystems ABI PrismŽ BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits. - 8. Technical Manual 7/1999, Promega Gene PrintŽ STR Systems (Silver Stain Detection). - 9. Yoshida K., Sekiguchi K., Kasai K., Sato H., Seta S. (1997): Evaluation of new primers for CSF1PO. Int. J. Leg. Med. 110, 36-38.

Adres pierwszego autora:

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

ul. Curie Skłodowskiej 3A

80-210 Gdańsk