Śmiertelne zatrucie kokainą

Z Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej AM w Lublinie

Kierownik: prof. dr hab. R. Mądro

Przedstawiono procedury analityczne zastosowane do identyfikacji i oznaczenia kokainy (C) oraz jej metabolitu (benzoiloekgoniny - BE) w materiale biologicznym zabezpieczonym podczas sekcji zwłok 35-letniego mężczyzny, w którym relacje stężeń C/BE (w m g/g) wynosiły: 7,9 / 9,5 - we krwi, 1091,0 / 364,9 - w żołądku wraz z treścią, 9,9 / 21,7 - w wątrobie i 11,6 / 26,5 - w nerce. Podano również prosty sposób otrzymywania wzorca benzoiloekgoniny z chlorowodorku kokainy.

The paper presents analytical procedures used for identification and quantification of cocaine (C) and its metabolite benzoylecgonine (BE) in autopsy material in a 35-year-old man. The concentration rate of C/BE (in m g/g) were as follows: 7.9 / 9.5 - in blood, 1091.0 / 364.9 - in the stomach with contents, 9.9 / 21.7 - in the liver and 11.6 / 26.5 - in the kidney. Moreover, a simple method of benzoylecgonine production from cocaine hydrochloride was presented.

Słowa kluczowe: kokaina, benzoiloekgonina, oznaczanie, materiał sekcyjny.

WSTĘP

W ostatnich latach w Polsce obserwuje się zmianę profilu narkomanii w kierunku środków o działaniu pobudzającym. Powszechnie stosowane są syntetyzowane w Polsce amfetaminy, a ostatnio także kokaina (6, 21).

W piśmiennictwie krajowym, znaleźć można jedynie ogólne omówienia kokainizmu jako jednego z typów uzależnień. Pojedyncze prace dotyczą identyfikacji kokainy w próbkach skonfiskowanych na rynku przez służby policyjne i celne (11, 17, 27, 28). Brak jest natomiast publikacji związanych z wykrywaniem kokainy w organizmie człowieka, zwłaszcza w materiale pośmiertnym.

Pierwszy przypadek zgonu z powodu zatrucia kokainą, który był badany w Zakładzie Medycyny Sądowej w Lublinie, ujawnił rozmiar problemów związanych z identyfikacją oraz ilościowym oznaczaniem kokainy w materiale sekcyjnym, w toku nieukierunkowanej analizy toksykologicznej. Kokaina należy bowiem do związków mało stabilnych, co sprawia, że jej wykrywanie w materiale pośmiertnym nie jest proste.

Kokaina (C) - podwójny ester ekgoniny oraz kwasu benzoesowego i alkoholu metylowego jest alkaloidem o działaniu miejscowo znieczulającym i zwężającym naczynia krwionośne. Wywołuje pobudzenie ośrodkowego układu nerwowego i zakończeń nerwów współczulnych. Ośrodkowe działanie C polega na porażeniu w mózgu strefy hamowania, co prowadzi do ogólnego pobudzenia i euforii. Ponadto C znosi uczucie zmęczenia, głodu i pragnienia. Natomiast w zatruciu ostrym może spowodować utratę przytomności, porażenie ośrodka oddechowego, zaburzenia rytmu serca, a nawet zgon (4, 8, 12).

W organizmie człowieka C podlega wielu przemianom biochemicznym, które prowadzą do powstania licznych metabolitów, z których benzoiloekgonina (BE) i ester metylowy ekgoniny (metyloekgonina, EME) stanowią ponad 80% (1, 12, 13).

MATERIAŁ, METODY I WYNIKI BADAŃ

Sekcja zwłok 35-letniego mężczyzny (znalezionego w samochodzie na terenie miejsca pracy) i wykonane później badania histologiczne nie wykazały uchwytnych zmian. We krwi zmarłego nie stwierdzono hemoglobiny tlenkowęglowej i alkoholu etylowego. W tej sytuacji Prokuratura zdecydowała się na przeprowadzenie nieukierunkowanych badań toksykologicznych, do których oprócz krwi (pęcherz moczowy był pusty) zabezpieczono żołądek z treścią oraz fragmenty wątroby i nerki.

1) Materiał sekcyjny potraktowano rutynowo. Próbki odbiałczano met. siarczanowo-amonową (5). Zastosowano ekstrakcję ciągłą typu ciecz-ciecz, eterowo-kwaśną i chloroformowo-alkaliczną, a oznaczenia wykonano metodami: chromatografii cienkowarstwowej (TLC), spektrofotometrii w nadfiolecie (UV) i wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).

Metodą TLC (w wyciągach chloroformowo-alkalicznych w układzie rozwijającym metanol-amoniak 100:1,5, po wybarwieniu jodoplatynianem potasu i kwasem solnym) oprócz plam o Rf=60 typowym dla wzorca C stwierdzono również dodatkowe plamy o Rf=25.

Analiza spektrofotometryczna UV eluatów z tych stref chromatograficznych wykazała w obu przypadkach identyczny kształt widma, z charakterystycznymi dla C maksimami absorpcji: przy 230, 274 i 281 nm (w etanolu) oraz przy 233 i 275 nm (w 0,1 N HCl). Na tej podstawie założono, że dodatkowa substancja wykryta w analizowanym materiale biologicznym jest prawdopodobnie metabolitem C.

Eluaty plam chromatograficznych zbadano następnie metodą HPLC (chromatograf f-my Gilson, kolumna ZORBAX ODS, faza ruchoma: acetonitryl- 0,05 M dwuwodorofosforan potasu pH=2,3 64:36, detektor UV - 233 nm) i dla plam o Rf=60 uzyskano piki o czasie retencji (t_r)=4,2 min., typowym dla wzorcowej C, podczas gdy dla plam o Rf=25 t_r wynosił 3,5 min.

Takie same wyniki otrzymano w trakcie analizy (TLC, UV i HPLC) bardzo starego wzorca C. Potwierdzało to hipotezę, że w badanym materiale wykryto produkt rozkładu ewentualnie metabolit C. Na tym etapie badań założono, że dodatkowa plama świadczy o obecności benzoiloekgoniny (BE).

2) Ze względu na brak wzorca BE zweryfikowanie hipotezy, że właśnie ten związek wykryto w badanym materiale sekcyjnym zależało od uzyskania wzorca o znanym stężeniu. W tym celu wodne roztwory o znanym stężeniu C ogrzewano na łaźni wodnej w temp. 100^oC przez czas określony, po czym oznaczano (met. HPLC) stężenie C, jak również jej metabolitu. BE jest bowiem produktem rozkładu C w roztworach wodnych i można ją uzyskać przez gotowanie C w wodzie (10). Okazało się przy tym, że już po 6 godzinach ogrzewania stężenie C w roztworze wynosiło tylko połowę stężenia wyjściowego.

Czas retencji (t_r) otrzymanego w ten sposób produktu rozpadu C (tj. BE) był identyczny z t_r eluatów dodatkowych plam TLC - uzyskanych zarówno w trakcie badania materiału sekcyjnego, jak i starego wzorca C. Wykazano zatem, że w zwłokach i w starym wzorcu oprócz C wykryto istotnie BE.

3) Następnie sprawdzono stabilność C podczas odbiałczania i ekstrakcji eterowej (tj. w kwaśnym środowisku). W tym celu wodne roztwory wzorcowe C zakwaszano do pH=4, ogrzewano przez 3 minuty w temp. 100^o, doprowadzano do pH=2 i przetrzymywano w temp. pokojowej przez 6 godzin, po czym badano met. HPLC. Ze względu na to, że nie ujawniono w nich piku typowego dla BE, uznano, że wstępne procedury analityczne nie powodują transformacji C do BE.

4) Te same (jak w p. 3) roztwory C poddano również warunkom ekstrakcji chloroformowo-alkalicznej (pH=8,5-9,0) tj. przechowywano je przez 1-6 godzin w temperaturze pokojowej i stwierdzono, że w środowisku zasadowym zachodził rozkład C do BE, której ilość zależała od czasu oddziaływania środowiska alkalicznego. Po 1, 3 i 6 godzinach stanowiła ona bowiem w przybliżeniu odpowiednio 1/10, 1/5 i ponad 1/3 pierwotnej zawartości C. Wykazano więc, że izolacja C metodą ciecz-ciecz musi być prowadzona możliwie szybko i powinna uwzględniać straty wynikające z rozkładu tego ksenobiotyku w środowisku zasadowym.

5) Wyniki doświadczeń (jak w p. 2, 3 i 4) wykorzystano do oznaczenia stężeń C i BE w próbkach materiału sekcyjnego metodą HPLC (jak w p. 1), po uprzednim rozdziale C i BE metodą TLC i elucji plam 0,1 N HCl. Jako wzorca użyto roztworu C (po gotowaniu), w którym (w sposób podany w p. 2) obliczono zawartość BE. Obliczenia wykonywano przy zastosowaniu komputerowego programu Gilson 715 i stwierdzono, że relacje stężeń C/BE (wyrażone w m g/g) w materiale sekcyjnym wynosiły: 7,9 / 9,5 - we krwi, 1091,0 / 364,9 - w żołądku wraz z treścią, 9,9 / 21,7 - w wątrobie i 11,6 / 26,5 w nerce.

6) Ze względu na wdrożeniowy charakter ekspertyzy zwróciliśmy się do Instytutu Ekspertyz Sądowych w Krakowie z prośbą o analizę sporządzonego przez nas alkalicznego ekstraktu żołądka z treścią metodą chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią masową Analiza wykonana przy użyciu aparatu firmy FINNIGAN MAT i kolumny DB-5 MS potwierdziła rezultaty naszych oznaczeń, gdyż wykazała C i BE, a ponadto (w małych ilościach) EME, norkokainę i etylobenzoiloekgoninę.

Podjęto również próbę otrzymywania BE z łatwo dostępnego na rynku krajowym C-HCl.

Zastosowano zmodyfikowaną metodę Lamperta i Stewarta (18). Dwie próbki po 0,5 g C-HCl poddawano I etapowi procedury analitycznej przedstawionej na ryc. 1, której produkt (BE) odzyskiwano z fazy wodnej dwoma sposobami: przez odparowanie (etap II/1) oraz przez ekstrakcję (etap II/2).

Następnie z BE"1" oraz BE"2" sporządzono po trzy metanolowe roztwory o identycznym stężeniu (1 mg/ml) i analizowano metodami TLC, UV oraz HPLC.

Na płytki chromatograficzne nanoszono 5, 10 i 20 m l tych roztworów. Stosowano układ rozwijający złożony z octanu etylu- metanolu- amoniaku 60:30:6 oraz odczynnik Dragendorffa z 20% kwasem siarkowym jako system wybarwiający.

Krzywe spektrofotometryczne w zakresie 210-350 nm wykonano dla roztworów BE o stężeniu 20 m g/ml (w metanolu i w 0,1 N HCl).

Tabela I. Rezultaty oznaczeń benzoiloekgoniny (BE) we wzorcowych roztworach (5 m g/ml) sporządzonych z BE"1" i BE"2" (otrzymanych w sposób przedstawiony na ryc. 1).

Table I. The results of benzoylecgonine (BE) quantitation in standard solutions (5 m g/ml) formed from BE"1" and BE"2" (obtained in the way presented in Fig. 1)

- średnia, SD - odchylenie standardowe, VC - współczynnik zmienności

- mean, SD - standard deviation, VC - variation coefficient

Ryc. 1. Schemat otrzymywania benzoiloekgoniny (BE) z chlorowodorku kokainy

(C-HCl).

Fig. 1. A diagram of production of benzoylecgonine (BE) from cocaine hydrochlo

ride (C-HCl).

Do analizy ilościowej metanolowych roztworów BE"1" i BE"2" (po 200-krotnym rozcieńczeniu wodą dejonizowaną do stężenia 5 m g/ml) zastosowano metodę HPLC (przy użyciu chromatografu f-my Gilson; kolumny Hypersil ODS 250x4,0 mm, 5m m; fazy ruchomej o składzie: bufor fosforanowy pH 3 - acetonitryl w proporcjach 80:20; prędkości przepływu 1 ml/min.; objętości wstrzykiwanej próbki - 10 m l oraz detekcji UV - 233 nm). Rezultaty tych oznaczeń zawiera tabela I.

OMÓWIENIE WYNIKÓW I DYSKUSJA

Przyjmuje się, że stężenia C we krwi w granicach 0,25-5 m g/ml są toksyczne, zaś śmiertelne rozpoczynają się od 1 m g/ml (7). Mittleman i Wetli (22) na podstawie 26-ciu przypadków obliczyli, że śmiertelne stężenie tego ksenobiotyku we krwi wynosiło średnio 6,2 m g/ml. Obserwowali jednak duży rozrzut (0,1-20,9 m g/ml) i brak zależności stężenia od sposobu zażycia (0,1-20,9 m g/ml po iniekcji dożylnej i 0,6-16,6 m g/ml po zastosowaniu tabaczki). W rzadziej spotykanych śmiertelnych zatruciach drogą pokarmową także wykazywano różne, chociaż w większości przypadków wysokie, stężenia C we krwi: od 0,38 do 330 m g/ml (2, 3, 19, 23, 24, 29). Znacznie zróżnicowane były również stężenia C w narządach wewnętrznych osób, które zmarły w wyniku ostrego zatrucia: 0,1-51,3 m g/g w wątrobie (2, 3, 9, 14, 20, 25, 26, 29) oraz 10,2-58 m g/g w nerce (9, 20, 25, 26, 29).

W świetle powyższych danych w analizowanym przypadku stężenia C i jej metabolitu BE we krwi, żołądku, wątrobie i nerce należało uznać za wysokie. Po wykluczeniu urazu (bezpośrednie wyniki autopsji) i zmian chorobowych (w oparciu o obserwacje makro i mikroskopowe), a także zatrucia: CO, etanolem i innymi alkoholami oraz innymi środkami uzasadnione było więc przyjęcie, że śmierć spowodowana została ostrym doustnym zatruciem kokainą.

Postępowanie analityczne wybiegało jednak poza znane schematy i ujawniło skalę trudności, z jakimi może zetknąć się analityk podczas oznaczania C w materiale sekcyjnym. W aspekcie diagnostycznym omówiony przypadek był"szczęśliwy" ze względu na sprzyjające okoliczności, takie jak krótki czas od zgonu do sekcji zwłok, szybkie zlecenie badań toksykologicznych w poszerzonym zakresie oraz wysokie stężenia C w materiale sekcyjnym. W innych przypadkach analiza i ocena jej wyników mogą nastręczać znaczne trudności wynikające m.in. ze wspomnianych wyżej dużych rozpiętości stężeń C w materiale pośmiertnym. Podstawowy problem stanowi jednak niska stabilność C w tkankach i płynach biologicznych (15, 16). W związku z tym w analizie toksykologicznej uwzględnić należy co najmniej jeden z jej głównych metabolitów tj. BE lub EME.

Z powyższych względów godna polecenia wydaje się zaprezentowana w tej pracy procedura otrzymywania BE. Pozwala ona bowiem na szybkie uzyskanie tego związku (o wysokim stopniu czystości umożliwiającym stosowanie go jako wzorca w metodach TLC, UV i HPLC) z łatwo dostępnego na rynku krajowym chlorowodorku kokainy.

WNIOSKI

1. W trakcie analizy C jest stabilna w środowisku kwaśnym (podczas odbiałczania i ekstrakcji eterowej), natomiast w środowisku alkalicznym (ekstrakcja chloroformowa) w miarę upływu czasu C rozkłada się do BE.
2. W związku z powyższym należy maksymalnie skrócić czas oddziaływania alkalicznego pH na badany materiał i uwzględnić w analizie jakościowej oraz ilościowej BE jako główny metabolit C oraz główny produkt jej degradacji.
3. Uzyskanie wzorca BE z ogólnie dostępnego chlorowodorku kokainy (w sposób podany w tej pracy) jest proste i pozwala na obniżenie kosztów ekspertyzy.

PIŚMIENNICTWO

1. Ambre J.J., Conelly T.J., Ruo T.I.: A kinetic model of benzoylecgonine disposition after cocaine administration in humans. J. Anal. Toxicol., 1991, 15, 17-20. -2. Amon C.A., Tate L.G., Wright R.K., Matusiak W.: Sudden death due to ingestion of cocaine. J. Anal. Toxicol., 1986, 10. W: Cocaine: Determination in Human Body Fluids. Reprints of selected articles from the Journal of Analytical Toxicology. Collected and arranged by R. C. Baselt and E. Espe. Preston Publications, Niles, 104-105. -3. Bednarczyk L.R., Gressmann E.A., Wymer R.L.: Two cocaine-induced fatalities. J. Anal. Toxicol., 1980, 4. W: Cocaine: Determination in Human Body Fluids. Reprints of selected articles from the Journal of Analytical Toxicology. Collected and arranged by R. C. Baselt and E. Espe. Preston Publications, Niles, 72-74. -4. Bogusz M., Schmidt G.: Cocain-Missbrauch - Neue Bedrohung mit der alten Substanz. Z. Rechtsmed., 1991, 35, 783-793. -5. Borkowski T.: Metoda wyosobniania trucizn organicznych z materiału biologicznego. Arch. Med. Sąd. i Krym., 1968, 18, 95-100. -6. Chruściel T.L.: Współczesna scena narkotyków w Polsce w świetle ustawy o przeciwdziałaniu narkomanii. Arch. Med. Sąd. i Krym., Suplement 1, 2001, 50, 3-14. -7. Clarke E.G.C.: Isolation and Identification of Drugs in Pharmaceutical., Body Fluids and Post-Mortem Material. The Pharmaceutical Press, London 1986. -8. Cregler L.L., Mark H.: Medical complications of cocaine abuse. N. Engl. J. Med., 1986, 315, 1495-1500. -9. Di Maio V.J.M., Garriott J.C.: Four deaths due to intravenous injection of cocaine. Forensic Sci. Int., 1978, 12, 119-125. -10. Findlay S.P.: The three-dimensional structur of cocaine. Part I. Cocaine and pseudococaine. JACS, 1954, 76, 2855-2862 - cyt. za: Matsubara K., Maseda Ch., Fukui Y.: Quantitation of cocaine, benzoylecgonine and ecgonine methyl ester by GC-CI-SIM after Extrelut extraction. Forensic Sci. Int., 1984, 26, 181-192.

11. Grabowska R., Sokołowska-Jabłońska Z.: Analiza substancji odurzających i psychotropowych w laboratoriach kryminalistycznych. Problemy Kryminalistyki, 1995, 207, 8-20. -12. Iten P.X.: Fahren unter Drogen - oder Medikamenteneinfluss. Forensische Interpretation und Begutachtung. Institut fűr Rechtsmedizin Forensische Toxikologie Universität Zurich 1994. -13. Jenkins A.J., Goldberger B.A.: Identification of unique cocaine metabolites and smoking by-products in postmortem blood and urine specimens. J. Forensic Sci., 1997, 42, 824-827. -14. Kisser W.: Über eine todliche Cocainvergiftung. Z. Rechtsmed., 1985, 94, 155-158. -15. Kiszka M., Buszewicz G., Mądro R.: Stability of cocaine in phosphate buffer and in urine. Z Zag. Nauk Sąd., 2000, 44, 7-23. -16. Kiszka M., Buszewicz G., Mądro R.: Stability of cocaine in blood and other tissue. Z Zag. Nauk Sąd., 2001, 45, 9-28. -17. Krawczyk W.: Analiza narkotyków metodą chromatografii gazowej i spektrometrii masowej. Problemy Kryminalistyki, 1994, 205, 3-9. -18. Lampert B.M., Stewart J.T.: Determination of cocaine and selected metabolites in canine and human serum by reversed-phase high-performance liquid chromatography on coupled cyanopropyl and silica columns. J. Chromatogr., 1989, 495, 153-165. -19. Lora-Tamayo C., Tena T., Rodriguez A.: Cocaine-related deaths. J. Chromatogr., 1994, 674, 217-224. -20. Lundberg G.D., Garriott J.C., Reynolds P.C., Cravey R.H., Shaw R.F.: Cocaine-related death. J. Forensic Sci.,1977, 22, 402-408.

21. Malewska M.: Narkotyki w szkole i w domu. Zagrożenie. TWiL, Warszawa 1995. -22. Mittleman R., Wetli Ch.V.: Death caused by recreational cocaine use. JAMA, 1984, 252, 1889-1893. -23. Patel F.: A high fatal postmortem blood concentration of cocaine in a drug courier. Forensic Sci. Int., 1996, 79, 167-174. -24. Peretti F. J., Isenschmid D. S., Levine B., Caplan Y. H., Smialek J. E.: Cocaine fatality: an unexplained blood concentration in a fatal overdose. Forensic Sci. Int., 1990, 48, 135-138. -25. Poklis A., Mackell M.A., Graham M.: Disposition of cocaine in fatal poisoning in man. J. Anal. Toxicol., 1985, 9. W: Cocaine: Determination in Human Body Fluids. Reprints of selected articles from the Journal of Analytical Toxicology. Collected and arranged by R. C. Baselt and E. Espe. Preston Publications, Niles, 96-98. -26. Poklis A., Maggin D., Barr J.: Tissue disposition of cocaine in man: a report of five fatal poisonings. Forensic Sci. Int., 1987, 33, 83-88. -27. Sokołowska-Jabłońska Z.: Zastosowanie wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w analizie skonfiskowanych próbek kokainy. Problemy Kryminalistyki, 1995, 205, 30-35. -28. Stanaszek R., Kała M., Chacia T.: Kokaina w laboratorium toksykologiczno-sądowym. Z Zag. Nauk Sąd., 1997, XXXV, 120-128. -29. Winek C.L., Wahba W.W., Rozin L., Janssen J.K.: An unusually high blood cocaine concentration in fatal case. J. Anal. Toxicol., 1987, 11. W: Cocaine: Determination in Human Body Fluids. Reprints of selected articles from the Journal of Analytical Toxicology. Collected and arranged by R. C. Baselt and E. Espe. Preston Publications, Niles, 106-109.

Adres autora:

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

ul. Jaczewskiego 8

20-090 Lublin