Marcin Woźniak, Anna Skowron, Jarosław Bednarek

Ocena polimorfizmu loci STR chromosomu Y: DYS19, DYS 389I, DYS389II i DYS 390 w populacji Kujawsko-Pomorskiej

Polymorphism of Y-STR loci: DYS19, DYS 389I, DYS389II i DYS 390 in Pomerania - Kujawy Region of Poland

Z Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej AM w Bydgoszczy

Kierownik: prof. dr hab. K. Śliwka

W pracy określono częstości alleli loci DYS19, DYS389I, DYS389II i DYS390. Obliczono zróżnicowanie genetyczne tych loci oraz podjęto próbę oceny wewnętrzpopulacyjnych zależności między haplotypami poprzez określenie podobieństwa alleli składających się na poszczególne haplotypy. Porównano również częstości haplotypów populacji kujawsko-pomorskiej z innymi populacjami europejskimi.

This paper is a study of four Y-STR loci: DYS19, DYS389I, DYS389II and DYS390 in the population of Pomerania Kujawy region of Poland. The loci were amplified together in a quadruplex reaction, amplification products were separated on ABI 377 sequencer and genotyped. Allelic frequencies as well as gene diversity were assessed together and intra-population haplotype similarities. The population's haplotype frequencies were compared with those of other European populations.

WSTĘP

Loci STR zlokalizowane na chromosomie Y (Y-STR) stanowią jedno z najnowszych narzędzi stosowanych w analizie polimorfizmu DNA człowieka. Dzięki dziedziczeniu wyłącznie w linii męskiej i silnemu sprzężeniu genetyczne-mu połączonemu z wysokim polimorfizmem stanowią one cenne uzupełnienie metod stosowanych dotychczas w badaniach nad rozprzestrzenianiem się ludzkich populacji i zasiedlaniem Ziemi przez nasz gatunek (1). Coraz większego znaczenia nabierają również zastosowania układów mikrosatelitarnych chromosomu Y w medycynie sądowej, szczególnie w przypadkach gwałtów zbiorowych i w szczególnych sprawach związanych z dochodzeniem spornego ojcostwa. Zastosowanie loci Y-STR w medycynie sądowej wymaga dokładnego rozpoznania charakterystyki genetycznej tych loci oraz ich zmienności wewnątrz - i międzypopulacyjnej (3).
Celem niniejszej pracy było scharakteryzowanie 4 loci Y-STR: DYS19, DYS389I, DYS389II i DYS390 w populacji kujawsko-pomorskiej oraz porównanie rozkładu haplotypów w tej populacji z innymi populacjami zamieszkującymi Europę.
MATERIAŁY I METODY
Materiał badany stanowił DNA wyizolowany metodą ekstrakcji organicznej (10) z krwi obwodowej pobranej od 208 niespokrewnionych mężczyzn. Ocenę stężenia DNA prowadzono metodą hybrydyzacyjną z wykorzystaniem zestawu QuantiBlot ™ (Perkin Elmer). Sekwencje starterów amplifikujących loci DYS19, DYS 389I, DYS389II i DYS 390 wraz z sugerowanymi warunkami amplifikacji uzyskano z literatury (5). Amplifikację prowadzono w objętości 25 ml, w następujących warunkach: 2U polimerazy Taq (Promega), MgCl2 2mM, trójfosforany deoksynukleotydów 0.2 mM każdy, BSA 0.4 mM, startery dla locus DYS19 0.24mM, DYS 389I/II 0.24mM, DYS390 0.16 mM. Warunki amplifikacji: denaturacja wstępna 95oC, 1min.; denaturacja właściwa 94oC, 1 min.; annealing starterów 55 oC, 1 min.; elongacja 72 oC 2 min.; 29 cykli; elongacja końcowa 72 oC, 7 min. 1 ml produktu amplifikacji oraz 0.5 ml wewnętrznego standardu wielkości ILS600 (Promega) dodawano do 1.5 ml mieszaniny dextran blu-e/formamid i poddawano elektroforezie. Rozdział produktów PCR prowadzono w 5%, denaturującym żelu poliakrylamidowym (stosunek akrylamid/bisakrylamid 19:1, 7M mocznik) na automatycznym sekwenatorze ABI377 (Applied Biosys-tems), wykorzystując bufor boranowy. Analizę danych zebranych podczas elektroforezy prowadzono przy pomocy oprogramowania GeneScan™ v. 3.1 oraz Genotyper™ v. 2.0 (Applied Biosystems). Oznaczenie haplotypów poszczególnych loci przeprowadzono wykorzystując 6 próbek referencyjnych o znanym haplotypie, otrzymanych dzięki uprzejmości M. Kaysera (Uniwesytet Humboldta, Berlin). Dane dla populacji innych niż kujawsko-pomorska zaczerp-nięto z Europejskiej Bazy Danych Haplotypów Chromosomu Y (Y-chromosome Haplotype Reference Database - YHRD) dostępnej w Internecie pod adresem http://ystr.charite.de (8). Współczynnik zróżnicowania genetycznego (D) obliczono korzystając ze wzoru D=1-?(pi)2 gdzie pi - częstość i-tego allelu (11).
WYNIKI
Częstości alleli badanych loci STR chromosomu Y oraz wyniki obliczeń ich zróżnicowania genetycznego przedstawiono w Tabeli I

Tabela I. Częstości alleli badanych loci STR chromosomu Y (D - współczynnik zróżnicowania genetycznego danego locus).

Table I. Allele frequencies for Y-STR loci investigated (D - gene diversity for particular locus).

Allele loci DYS19, DYS389I, DYS389II i DYS390 występujące w populacji kujawsko-pomorskiej są identyczne z allelami obserwowanymi w innych populacjach na świecie, choć allel 18 locus DYS19, wykryty w naszej populacji, występuje w innych populacjach europejskich bardzo rzadko, tylko 6 razy na 7784 próbek zarejestrowanych w bazie YHRD, w tym w dwóch innych populacjach z terenu Polski.

Wśród badanych 208 próbek DNA stwierdzono występowanie 85 odmiennych haplotypów chromosomu Y, określonych przez allele loci DYS19, DYS389I, DYS389II i DYS 390, wśród których cztery występowały z częstością większą niż 5%. Pięćdziesiąt haplotypów pojawiło się tylko raz w badanej próbce. Wszystkie oznaczone haplotypy oraz częstości ich występowania przedstawiono w Tabeli II.

Na podstawie otrzymanych danych podjęto próbę określenia wzajemnych zależności pomiędzy haplotypami loci DYS19, DYS389I, DYS389II i DYS390 występującymi w populacji kujawsko-pomorskiej. Dla tych haplotypów, które zaobserwowano w badanej próbce co najmniej 2 razy wykreślono diagram ilustrujący podobieństwa pomiędzy nimi (Rycina 1). Przyjęto, że dwa dowolne haplotypy są podobne, jeśli różnią się między sobą wyłącznie w jednym locus a różnicę między allelami stanowi dla danej pary haplotypów nie więcej niż jedna jednostka repetytywna.

Na podstawie analizy diagramu podobieństw stwierdzono, że haplotypy loci DYS19, DYS389I, DYS389II i DYS390 występujące najczęściej w populacji kujawsko-pomorskiej (haplotypy nr 1, 2 i 3 wg numeracji z Tabeli II) charakteryzują się wysokim wzajemnym podobieństwem oraz są podobne do innych, rzadszych haplotypów występujących w tej populacji. Zaobserwowano również występowanie grupy haplotypów wzajemnie do siebie podobnych, które odróżniały się od pozostałych haplotypów w badanej populacji (haplotypy nr 4, 8, 14, 20, 22, 23, 24 i 25). Dla haplotypów oznaczonych numerami: 9, 16, 21, 30 i 35 nie znaleziono w obrębie badanej grupy żadnych haplotypów podobnych, choć haplotypy 21, 30 i 35 wykazywały podobieństwo do haplotypów oznaczonych odpowiednio numerami:46, 48 i 80, które, ze względu na jednokrotne wystąpienie w badanej próbce, nie zostały ujęte na diagramie.

Tabela II. Częstości haplotypów chromosomu Y dla loci DYS19, DYS389I, DYS389II i DYS290 w populacji kujawsko-pomorskiej; Nr - numer haplotypu, LH - ilość haplotypów danego typu w badanej populacji, p - procentowa częstość haplotypu.

Table II. Haplotype frequencies for DYS19, DYS389I, DYS389II and DYS290 loci in the Pomerania - Kujawy region. Nr - haplotype number, LH - haplotype count, p - haplotype frequency (in %).

Ryc. 1. Ocena podobieństwa haplotypów występujących w populacji kujawsko-pomorskiej. Na diagramie ukazano wszystkie haplotypy, które wystąpiły w badanej populacji co najmniej 2 razy. Numeracja odpowiada numerom haplotypów z Tabeli II. Wielkość okręgu odzwierciedla częstość danego haplotypu w populacji. Podobieństwo danej pary haplotypów wskazuje łącząca je linia. Linia przerywana łączy ze sobą grupę haplotypów, które są wzajemnie podobne i różne od reszty haplotypów w badanej grupie.

Fig. 1. Similarities beteween haplotypes observed in the Pomerania - Kujawy population. The diagram shows all haplotypes that occured at least twice in our population sample. Haplotype numbers are the same as in the Table II. The circle size reflects haplotype frequency. Similar haplotypes are connected by lines. Dashed lines connect haplotypes which are mutually similar and distinct from all other haplotypes in the group.

Dla czterech haplotypów loci DYS19, DYS389I, DYS389II i DYS390 występujących najczęściej w populacji kujawsko-pomorskiej uzyskano z bazy YHRD dane opisujące ich występowanie w innych populacjach. Doboru populacji dokonano na podstawie kryteriów geograficznych i etnicznych tak, aby stanowiły one możliwie reprezentatywną próbkę populacji europejskich. Wyniki porównania częstości występowania wybranych haplotypów na terenie Europy przedstawiono na Rycinie 2.

Ryc. 2. Porównanie dystrybucji najczęstszych w populacji kujawsko-pomorskiej haplotypów w wybranych populacjach europejskich.

Fig. 2. A comparison of haplotype distribution in different European populations for the four most common haplotypes in the Pomerania - Kujawy population sample.

Dyskusja

Loci mikrosatelitarne chromosomu Y, mimo że pod wieloma względami podobne do loci autosomalnych, spełniają odmienną od nich funkcję w badaniach z zakresu identyfikacji osobniczej. Ze względu na występowanie silnego sprzężenia genetycznego i brak rekombinacji, Y-STR nie są tak efektywnym narzędziem identyfikacyjnym, jak autosomalne loci STR (4). Wymienione cechy sprawiają jednak, że Y-STR mogą spełniać pewne funkcje, które czynią je użytecznymi. Rozwój technik analizy mikrosatelitów chromosomu Y umożliwił opracowanie szybkich metod identyfikacji linii ojcowskiej opartych na technice PCR i rozdziale elektroforetycznym z wykorzystaniem fluorescencyjnych metod detekcji fragmentów DNA. Możliwości te znajdują szczególne zastosowanie w trudnych przypadkach analizy pokrewieństwa, gdy dostępny jest wyłącznie materiał porównawczy od osób niespokrewnionych w pierwszej linii (6). Możliwości takie do niedawna oferowała jedynie analiza DNA mitochondrialnego (2). Ze względu na niewielkie rozmiary alleli Y-STR możliwa jest ich amplifikacja ze zdegradowanego DNA co czyni je doskonałym narzędziem wspomagającym i uzupełniającym analizę genetyczną śladów biologicznych (7). Inne zastosowania loci mikrosatelitarnych chromosomu Y obejmują wykorzystanie danych populacyjnych uzyskanych dla tych loci do wzbogacania wiedzy o pochodzeniu ludzkich zbiorowisk zamieszkujących określony region geograficzny (9). Jednocześnie, ze względu na czynniki biologiczne, historyczne i kulturowe regulujące przepływ chromosomów Y między pokoleniami, obecnie istniejące populacje wykazują duże zróżnicowanie pod względem częstości występowania poszczególnych haplotypów chromosomu Y (13). Różnice te mogą być tak duże, że w niektórych przypadkach możliwe jest określenie na podstawie markerów genetycznych chromosomu Y regionu geograficznego lub grupy etnicznej, z której pochodzi dany mężczyzna (4).

W zastosowaniach Y-STR dla potrzeb identyfikacji osobniczej na plan pierwszy wybija się zatem potrzeba szczegółowego poznania struktury populacji, z której pochodzą mężczyźni, których DNA jest przedmiotem badań. Częstości alleli loci DYS19, DYS389I, DYS389II i DYS390 oznaczone w populacji kujawsko-pomorskiej różnią się od częstości opublikowanych dla innych populacji (5), natomiast zróżnicowanie genetyczne tych loci osiąga wartości zbliżone. Zjawisko zróżnicowania częstości alleli loci Y-STR w różnych populacjach jest powszechnie obserwowane i wiąże się ze specyficznym sposobem dziedziczenia chromosomu Y(13).

Wewnętrzna struktura populacji uzależniona jest od zmian liczebności populacji efektywnej, ewentualnego dopływu lub ubytku chromosomów Y (w wyniku migracji, chorób, wojen itp.) oraz od częstotliwości mutacji w obrębie analizowanych markerów genetycznych (4). Przeprowadzona analiza podobieństwa haplotypów w populacji kujawsko-pomorskiej wykazała istnienie silnych powiązań między haplotypami najczęstszymi w tej populacji. Wynik taki może być efektem rzeczywistych związków pomiędzy poszczególnymi haplotypami, wynikających z przechodzenia jednych haplotypów w inne na drodze mutacji, ale może również odzwierciedlać inne zjawiska, jak np. domieszki obcych haplotypów, które są identyczne bądź podobne do haplotypów już występujących w populacji. O występowaniu takiego zjawiska może świadczyć obecność w badanej populacji całej grupy haplotypów podobnych do siebie i różnych od pozostałych jak również obecność haplotypów, które nie wykazują podobieństwa do żadnego z pozostałych haplotypów występujących w badanej populacji. Należy również zauważyć, że przyjęty na potrzeby niniejszej pracy model powstawania nowych haplotypów loci Y-STR na drodze insercji bądź delecji pojedynczych powtórzeń, choć najbardziej prawdopodobny, nie musi być prawdziwy dla każdego przypadku powstania nowego haplotypu (12). Nie można również wykluczyć, że haplotypy, które są identyczne w zakresie badanych loci, po przeprowadzeniu analizy dodatkowych loci Y-STR zostaną zakwalifikowane do odmiennych grup. Analiza dodatkowych loci Y-STR dla badanego zestawu próbek jest obecnie w toku.

Ze względu na, spowodowane sprzężeniem genetycznym, wspólne dziedziczenie całych zestawów alleli chromosomu Y, w przypadku porównań miedzypopulacyjnych konieczna jest analiza różnic częstości całych haplotypów. Przeprowadzone porównania międzypopulacyjne wykazały, że haplotypy, które są najczęstsze w populacji kujawsko-pomorskiej, występują również stosunkowo często w populacjach Europy wschodniej i centralnej oraz w populacjach Słowian, natomiast przeważnie nie występują (lub ich częstości są znacząco odmienne), w populacjach Europy Południowej. Na szczególną uwagę zasługuje haplotyp oznaczony w Tabeli II numerem 2, którego częstość występowania w populacjach Polskich (Bydgoszcz, Gdańsk, Wrocław i Warszawa) jest wyższa niż w pozostałych badanych populacjach Europy.

Przedstawione wyniki są kolejnym etapem badań mających na celu możliwie pełne zidentyfikowanie polimorfizmu ludzkiego chromosomu Y w populacji Pomorza i Kujaw. Wspomniane już rozszerzenie prowadzonych badań o kolejne loci oraz zwiększenie ilości osobników w badanej próbce powinno pozwolić na pełniejsze zrozumienie zróżnicowania genetycznego tego chromosomu i lepsze jego wykorzystanie w dziedzinie identyfikacji osobniczej.

Piśmiennictwo

1. Casanova M., Leroy P., Boucekkine C., Weissenbach J. Bishop C., Fellous M., Purello M., Fiori G., Siniscalco M. A Human Y-linked DNA Polymorphis and its Potenetial for Estimating Genetic and Evolutionary Distance. Science 1985, 230, 1403-1406. -2. Gill P., Ivanov P.L., Kimpton C., Piercy R., Benson N., Tully G., Evett I., Hagelberg E., Sullivan K. Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis. Nature Genetics 1994, 6, 130-135. -3. Jobling M.A., Pandya A., Tyler-Smith C., The Y chromosome in forensic analysis and paternity testing. Internationa Journal of Legal Medicine. 1997, 110, 118-124. -4. Jobling M., Tyler-Smith C. Fathers and sons: the Y chromosome and human evolution.Trends in Genetics 1995, 11, 449-455. -5. Kayser M. i wsp. Evaluation of Y-chromosomal STRs: a multicenter study. International Journal of Legal Medicine 1997, 110, 125-133. -6. Kayser M., Krüger C., Nagy M., Geserick G., de Knijf P., Roewer L. Y-chromosomal DNA - analysis in paternity testing:experiences and recommendations. Progress in Forensic Genetics, 1998, 7, 494-496. -7. Prinz M., Boll K., Baum H., Shaler B. Multiplexing of Y chromosome specific STRs and perfomance for mixed samples. Forensic Science International, 1997, 85, 209-218. -8. Roewer L. i wsp. Online reference database of European Y-chromosomal short tandem repeat (STR) haplotypes. Forensic Science International 2001, 118, 106-113. -9. Roewer L, Kayser M., Dieltjes P., Nagy M., Bakker E., Krawczak M., de Knijf P., Analysis of molecular variance (AMOVA) of Y - chromosome - specific microsatellites in two closely related human populations. Human Molecular Genetics, 1996, 5, 1029 - 1033. 10. Sambrook J, Fritsh EF, Maniatis T (1989) Analysis and cloning of eucaryotic genomic DNA. Molecular cloning, a laboratory manual. wyd. Cold Spring Harbor 1989, 9.16-9.23.

11. Weir B. w Genetic Data Analysis II wyd. Sinauer Associates, Inc. Publishers, Sunderland, Massachusetts 1996, 150-156. -12. Weber JL, Wong C. Mutation of human short tandem repeats. Human Molecular Genetics 1993, 8, 1123-1128. -13. Santos F. R., Gerelsaikhan T., Munkhtuja B., Oyunsuren T., Epplen J. T., Pena S. D. J., Geographic differences in the allele frequencies of the human Y - linked tetranucleotide polymorphism DYS19. Human Genetics 1996, 97, 309-313.

Adres pierwszego autora:

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

ul. M. Curie Skłodowskiej 9

85-094 Bydgoszcz