Polimorfizm loci VNTR: D7S21, D12S11 i D1S7 w populacji kujawsko-pomorskiej

Z Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej AM w Bydgoszczy

Kierownik: prof. dr hab. K. Śliwka

W pracy przedstawiono częstości alleliczne w loci VNTR: D7S21, D12S11 i D1S7 w populacji regionu kujawsko-pomorskiego. Obserwowany rozkład częstości genotypów w analizowanych loci jest zgodny z rozkładem częstości genotypów wyznaczonym na podstawie częstości allelicznych według prawa Hardy’ego-Weinberga. Obliczone dla poszczególnych loci: heterozygotyczność, wskaźnik zawartości informacji polimorficznej, siła dyskryminacji, teoretyczna szansa wykluczenia niesłusznie pozwanego mężczyzny i średnia teoretyczna szansa ojcostwa wskazują na dużą przydatność analizowanych układów dla potrzeb medycyny sądowej.

This paper presents the results of a population study for 3 VNTR loci: D7S21, D12S11 and D1S7. Blood samples were obtained from healthy unrelated individuals from the Pomerania-Kujawy region of Poland. DNA was extracted from blood by organic extraction. 5 m g of genomic DNA was digested with Hinf I and resolved by agarose gel electrophoresis. Loci D7S21, D12S11 and D1S7 was analysed by Southern blot techniques using DNA probes: MS 31, MS 43A and MS 1. Hybridization was performed according to the manufacturers’ instructions. DNA fragment size was estimated by measuring their mobility relative to DNA NICE DNA Analysis Ladder using BKA Fingerprint v 2.1 software. DNA fragments were grouped using fixed bin methods to a size class (bins); the boudaries of the bins were determined by using a set of size-standard markers. The allele distributions were in accordance with Hardy-Weinberg expectations. High values of heterozigosity, polymorphic information contents, power of discrimination, mean exclusion chance and typical paternity index demonstrate that these systems are valuable tools for both paternity testing and routine forensic casework.

Słowa kluczowe: DNA, VNTR, genetyka populacyjna.

WSTĘP

Wśród 3 miliardów par zasad składających się na genom człowieka znajdują się sekwencje charakteryzujące się dużą zmiennością międzyosobniczą, czyli polimorfizmem. Wiele z nich to tzw. sekwencje powtarzające się, których zmienność wynika z różnej liczby powtórzeń jednostki repetytywnej. Jednym z rodzajów sekwencji powtarzających się są sekwencje minisatelitarne, zwane także VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) (11). Odkrycie przez Jeffreys’a sond molekularnych umożliwiających analizę, w oparciu o technikę Southern blot, polimorfizmu wielu loci VNTR jednocześnie (analiza multilocus) umożliwiło"zdejmowanie" pierwszych genetycznych"odcisków palców" (DNA fingerprints) (6). Technika ta szybko znalazła zastosowanie w badaniach spornego ojcostwa (7) analizie pokrewieństwa wykonywanej dla celów imigracyjnych (5) czy identyfikacji osobniczej (4). Z uwagi na nieswoistość gatunkową i brak możliwości dokładnego określenia analizowanych loci w tworzeniu"fingerprintów DNA" sondy multilocusowe zaczęto zastępować specyficznymi gatunkowo sondami jednolocusowymi (14). Prócz medycyny sądowej znalazły one zastosowanie w mapowaniu sprzężeń genomu człowieka (10, 12).

Przed wprowadzeniem jakiegokolwiek markera do badań wykonywanych dla potrzeb identyfikacji osobniczej i dochodzenia spornego ojcostwa konieczna jest dokładna charakterystyka jego polimorfizmu w danej populacji. W niniejszej pracy przedstawiono polimorfizm loci VNTR D7S21, D12S11 i D1S7 (14) w populacji kujawsko-pomorskiej.

MATERIAŁY I METODY

Materiał do badań stanowiła krew obwodowa pobrana z żyły łokciowej, w zależności od badanego locus od 466-551 zdrowych, dorosłych, niespokrewnionych osób, mężczyzn i kobiet z regionu kujawsko-pomorskiego.

DNA izolowano z 5 ml krwi obwodowej tzw."metodą organiczną" (13). Stężenie i czystość DNA oceniano metodą spektrofotometryczną wykorzystując"GeneQuant DNA/RNA Calculator" (Pharmacia-Biotech). 5 m g DNA poddawano trawieniu endonukleazą Hinf I (Promega Co.) według zaleceń producenta. Produkty trawienia rozdzielano w 0.9% żelu agarozowym (Promega Co.) o drodze rozdziału długości 25 cm w buforze 1XTBE przez 42 godziny przy napięciu 1 V / cm z recyrkulacją buforu. Po zakończeniu rozdziału DNA poddawano fragmentacji w 0.25 M HCl, następnie denaturowano (0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl) i neutralizowano (0.5 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.4). DNA przenoszono na nylonową membranę neutralną (Biodyne A, GibcoBRL) metodą kapilarną w buforze 10XSSC przez 16 godzin i wiązano z membraną poprzez naświetlanie promieniami UV przez 3 minuty. Hybrydyzację prowadzono zgodnie z zaleceniami producenta wykorzystując sondy molekularne: NICE OLIGO DNA PROBE MS31 (Cellmark Diagnostics) dla analizy locus D7S21, NICE OLIGO DNA PROBE MS43A (Cellmark Diagnostics) dla analizy locus D12S11 i NICE OLIGO DNA PROBE MS1 (Cellmark Diagnostics) dla analizy locus D1S7. Detekcję chemiluminescencyjną wykonano zgodnie z protokołem producenta wykorzystując jako substrat LumiPhos 480 a produkty reakcji uwidaczniano na błonie rentgenowskiej (FOTON Warszawa). Wielkości fragmentów restrykcyjnych określono względem wzorca długości DNA NICE DNA Analysis Ladder (GibcoBRL), uwidocznionego dzięki hybrydyzacji z sondą NICE OLIGO DNA PROBE MW 100 (Cellmark Diagnostics) przy użyciu techniki komputerowej analizy obrazu z zastosowaniem videoscannera wraz z oprogramowaniem BKA Fingerprint v 2.1 firmy Biotec-Fisher GmbH.

Fragmenty pogrupowano, stosując metodę"fixed-bins" (3), pod względem wielkości łącząc je w grupy (biny) odpowiadające przedziałom markera wielkości DNA (NICE DNA Analysis Ladder). Na podstawie uzyskanych wyników, wykorzystując program"Genetic Data Analysis" (9), wyznaczono dla analizowanych loci: heterozygotyczność oczekiwaną (He) i heterozygotyczność obserwowaną (Ho). Parametry charakteryzujące przydatność analizowanych loci dla potrzeb medycyny sądowej, tj. zawartość informacji polimorficznej (PIC - Polymorphic Information Content) (1), siłę dyskryminacji (PD - Power of Discrimination) (8), teoretyczną szansę wykluczenia niesłusznie pozwanego mężczyzny (MEC - Mean Exclusion Chance) i teoretyczną średnią szansę ojcostwa (TPI - Typical Paternity Index) (2) wyznaczono wykorzystując program komputerowy"PowerStats" (program dostępny w sieci"Internet": www.promega.com). Zgodność obserowanych rozkładów częstości genotypów w poszczególnych loci z prawem Hardy’ego-Weinberga testowano obliczając prawdopodobieństwo zgodności wyliczone na podstawie testu dokładnego Fischera (exact p) w oparciu o program komputerowy"Genetic Data Analysis" (9).

WYNIKI I OMÓWIENIE

Częstości alleliczne w loci D7S21, D12S11 i D1S7, heterozygotyczność oczekiwaną (He), heterozygotyczność obserwowaną (Ho), zawartość informacji polimorficznej (PIC), siłę dyskryminacji (PD), teoretyczną szansę wykluczenia niesłusznie pozwanego mężczyzny (MEC) i teoretyczną średnią szansę ojcostwa (TPI) oraz prawdopodobieństwo zgodności rozkładu obserwowanych częstości genotypów z rozkładem częstości genotypów wyznaczonych w oparciu o częstości allelicznych według reguły Hardy’ego-Weinberga na podstawie testu dokładnego Fishera (exact p) przedstawiono w tabeli I.

Obserwowane w analizowanych loci rozkłady częstości genotypów są zgodne (p> 0.05) z rozkładami wyznaczonymi w oparciu o częstości alleliczne według reguły Hardy’ego-Weinberga.

Tabela I. Polimorfizm loci VNTR D7S21, D12S11 i D1S7 w populacji kujawsko-pomorskiej. N - ilość analizowanych genotypów, He - heterozygotyczność oczekiwana, Ho - heterozygotyczność obserwowana, PIC - zawartość informacji polimorficznej, PD - siła dyskryminacji, MEC - teoretyczna szansa wykluczenia niesłusznie pozwanego mężczyzny, TPI - teoretyczna średnia szansa ojcostwa, exact p - prawdopodobieństwo zgodności obserwowanego rozkładu częstości genotypów z prawem Hardy’ego-Weinberga.

Table I. Allele frequencies for VNTR loci: D7S21, D12S11 and D1S7 l in Caucasians from the Pomerania-Kujawy region of Poland.^. N - number of individuals analysed - He - expected hetrozygosity, Ho - observed heterozygosity, PIC - polymorphic information content, PD - power of discrimination, MEC - mean exclusion chance, TPI - typical paternity index, p - probability values of Exact tests for Hardy-Weinberg disequilibrium.

Ciąg dalszy tabeli I.

Z analizowanych loci najwyższym polimorfizmem, przejawiającym się nie tylko ilością alleli, ale przede wszystkim zawartością informacji polimorficznej i heterozygotycznością oraz największą przydatnością dla potrzeb identyfikacji osobniczej (wyrażoną siłą dyskryminacji) i dochodzenia spornego ojcostwa (wyrażoną teoretyczną szansą wykluczenia niesłusznie pozwanego mężczyzny i teoretyczną średnią szansą ojcostwa) charakteryzuje się locus D1S7. Analogiczne parametry dla dwóch pozostałych loci są niższe i dość do siebie zbliżone, chociaż locus D7S21 charakteryzują nieco wyższe aniżeli dla locus D12S11 wartości wszystkich wyznaczonych parametrów.

Łączna przydatność analizowanych loci dla potrzeb identyfikacji osobniczej wyraża się siłą dyskryminacji równą 0.999973. Łączna teoretyczna szansa wykluczenia niesłusznie pozwanego mężczyzny dla analizowanych loci wynosi 0.986 a teoretyczna średnia szansa ojcostwa 76.79.

Uzyskane wyniki wskazują, że analiza polimorfizmu loci D7S21, D12S11 i D1S7 może być cennym narzędziem w identyfikacji osobniczej i dochodzeniu spornego ojcostwa.

PIŚMIENNICTWO

1. Botstein D, White RL, Skolnick M, Davis RW: Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am J Hum Genet 1998, 32, 314-331. -2. Brenner CJ, Morris: Paternity index calculations in single locus hypervariable DNA probes: validation and other studies. 21-53 w Proceedings for the International Symposium on Human Identification 1989. Promega Corporation, Madison, WI. -3. Budowle B, Giusti AM, Waye JS, Baechtel FS, Fourney RM, Dwight E, Adams DE, Presley LA, Deadman HA, Monson KL: Fixed-Bin analysis for statistical evaluation of continuous distributions of allelic data from VNTR loci, for use in forensic comparison. Am J Hum Genet 1991, 48, 841-855. -4. Gill P, Jeffreys AJ, Werrett DJ: Forensic application of DNA"fingerprints". Nature 1985, 318, 577-579. -5. Jeffreys A.J, Brookfield JFY, Semeonoff R: Positive identification of an immigration test-case using human DNA Fingerprints. Nature 1985, 317, 818-819. -6. Jeffreys A.J, Wilson V, Thein SL. Hypervariable"minisatelite" regions in human DNA. Nature 1985, 314, 67-73. -7. Jeffreys A.J, Wilson V, Thein SL: Individual-specific"fingerprints" of human DNA. Nature 1985, 316, 76-79. -8. Jones DA: Blood samples: Probability of discrimination. J Forensic Sci Soc 1972, 12, 355-359. -9. Lewis PO, Zaykin D Genetic Data Analysis: Computer program for the analysis of alleleic data. Version 1.0. Free program distributed by the authors over the internet from the GDA Home Page at http:/ / chee.unm.edu/gda/. -10. Nakamura Y, Leppert M., O’Connell P, Wolff R, Holm T, Culver M., Martin C, Fujimoto E, Hoff M., Kumlin E, White R: Variable number of tandem repeat (VNTR) markers for human gene mapping. Science 1987, 235, 1616-1622.

11. Napierała M: Sekwencje powtarzające się w genomie człowieka w Genom człowieka - największe wyzwanie współczesnej genetyki i medycyny molekularnej - praca zbiorowa pod redakcją W. Krzyżosiaka, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1997, 56-69. -12. Napierała M: Mapa genetyczna genomu człowieka w Genom człowieka - największe wyzwanie współczesnej genetyki i medycyny molekularnej - praca zbiorowa pod redakcją W. Krzyżosiaka, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1997, 70-88. -13. Sambrooka J, Fritsch EF, Maniatis T: Analysis and cloning of eucaryotic genomic DNA. Molecular cloning a labolatory manual. Cold Spring Harbor Labolatory Press 1989, 16-22. -14. Wong Z, Wilson V, Patel I, Povey S, Jeffreys AJ: Characterization of a panel of highly variable minisatellites cloned from human DNA. Ann Hum Genet 1987, 51, 269-288.

Adres pierwszego autora:

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

ul. M. Curie Skłodowskiej 9

85-094 Bydgoszcz