Zofia Szczerkowska, Joanna Wysocka, Ewa Kapińska, Lidia Cybulska

Genetyczna zmienność w obrębie 14-tu loci typu VNTR w populacji Polski Północnej

Genetic variation at 14 VNTR loci in the North Poland population

Z Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej AM w Gdańsku

Kierownik: dr hab. Z. Szczerkowska - profesor AM

W pracy przedstawiono wyniki badań populacyjnych nad zróżnicowaniem fenotypowym w obrębie 14-tu loci typu AmpFLP i STR. DNA wyizolowano z krwi pełnej pobranej od dorosłych niespokrewnionych osób z terenu Polski północnej. Amplifikację analizowa-nych fragmentów DNA przeprowadzano zarówno w pojedynczych reakcjach PCR (loci: D1S80, D17S5, F13B, FGA, LPL) jak i metodą kompleksowego PCR (triplexy: CTT, FFv i DDD.) Produkty PCR rozdzielano na natywnych i denaturujących żelach poliakrylami-dowych i barwiono metodą srebrową. W oparciu o uzyskane częstości alleli obliczono wybrane parametry statystyczne (PD, PIC, PE, PM) wskazujące na wysoką przydatność analizowanych loci w medycynie sądowej.

The main aim of the paper was present the results of population data on genetic variation at 14 VNTR loci AmpFLP and STR types. DNA was isolated from blood samples taken from adult unrelated individuals of North area of Poland by non-enzymatic and non-organic method. Amplification was performed using both single PCR reaction (D1S80, D17S5, F13B, FGA, LPL) and multiplex PCR method (triplex: CTT, FFv, DDD). PCR products were separated using native and denaturate electrophoresis conditions and subsequent silver staining. Alleles were identified by comparing with allelic ladders. No deviation from the Hardy-Weinberg equilibrium were observed. Statistical parameters (PD, PIC, PE, PM) showed that examined systems are useful for forensic medicine.

Słowa kluczowe: PCR, AmpFLP, STR, częstość alleli.

Key words: PCR, AmpFLP, STR, allele frequencies.

Allele wysoce polimorficznych loci typu VNTR obejmujące zarówno minisateli-tarne układy AmpFLP jak i mikrosatelitarne sekwencje repetytywne DNA typu STR określane metodą PCR znalazły szerokie zastosowanie w medycynie sądowej, zarówno w analizie śladów biologicznych jak i w dochodzeniu ojcostwa (4, 6, 14).
Analiza tych markerów genetycznych stanowi obecnie rutynową praktykę laboratoriów genetycznych Zakładów Medycyny Sądowej. Niezbędny etap poprzedzający ich włączenie do badań stanowi określenie częstości profili DNA i analiza populacyjna.
W pracy przedstawiono wyniki badań nad zróżnicowaniem fenotypowym dwóch loci typu AmpFLP i dwunastu loci typu STR. Amplifikację analizowanych fragmentów DNA przeprowadzano zarówno w pojedynczych reakcjach jak i metodą kompleksowego PCR. Obliczono częstości alleli zwracając uwagę na rzadkie warianty fenotypowe. Oceniono przydatność analizowanych loci w praktyce sądowo-lekarskiej.

MATERIAŁ I METODY

Materiał do badań stanowił DNA wyizolowany z krwi pełnej pobranej od dorosłych, niespokrewnionych osób z terenu Polski północnej. Izolację DNA przeprowadzono metodą nieenzymatyczną (10). Stosując reakcję łańcuchową polimerazy określono allele 14-tu loci genowych, w tym dwóch typu AmpFLP (D1S80 i D17S5) oraz allele 12-tu loci typu STR (F13B, FGA, LPL, CSF1PO, TPOX, TH01, F13A01, FES/FPS, vWA, D13S317, D7S820, D16S539). Allele systemów D1S80 (n=589), D17S5 (n=310), F13B (n=426), FGA (n=474) oraz LPL (n=184) określono w pojedynczych reakcjach PCR. Produkty reakcji PCR loci: D1S80, D17S5, F13B i FGA rozdzielano w warunkach natywnych, a locus LPL w warunkach denaturujących.
W 300 próbkach DNA określono allele triplexów CTT (CSF1PO, TPOX, TH01), FFv (F13A01, FES/FPS, vWA), w 200 próbkach allele triplexu DDD (D13S317, D7S820 i D16S539). Do amplifikacji analizowanych fragmentów DNA zastosowano komercyjne zestawy Gene Print™ STR System Multiplex f-my "Promega". Produkty PCR rozdzielano elektroforetycznie na poliakrylamidowych żelach w warunkach denaturujących (Gene Page Plus 6% f-my "Amresco").
Do detekcji alleli zastosowano metodę srebrową wg Allena z niewielkimi modyfikacjami (1). Uzyskane wyniki poddano ocenie i analizie statystycznej.

WYNIKI I OMÓWIENIE

Przeprowadzone badania pozwoliły na prawidłowe określenie fenotypów wszystkich 14-tu analizowanych loci genowych zarówno mono jak i komplekso-wego PCR, a obliczone częstości fenotypowe były zgodne z regułą Hardy-Weinberga. W tabeli I przedstawiono częstości alleli analizowanych loci genowych.
Częstości alleli wykazane w badaniach nie odbiegały od danych innych populacji europejskich (11, 15, 18). Różnice w częstościach występowania niektórych alleli obserwowano przy porównaniu z populacjami m.in. Azji i Australii (7, 8, 9, 13, 19). W większości analizowanych loci genowych obserwowano także rzadziej pojawiające się allele (z częstością od 0,001 do 0,003). Podobnie niewielką ich częstość sygnalizowano również w innych populacjach (2, 3, 5, 17, 18, 20), w tym również w pozostałych rejonach Polski (12, 16).

Tabela I. Częstości alleli 14 loci genowych w populacji Polski północnej.

Table I. Allele frequencies of 14 loci in the North Poland population.

W oparciu o uzyskane wyniki obliczono wybrane parametry statystyczne charakteryzujące przydatność analizowanych loci genowych w medycynie sądowej: współczynnik dyskryminacji (PD), informatywność polimorficznego układu (PIC), siłę wykluczenia ojcostwa (PE) i prawdopodobieństwo przypadko-wej zgodności (PM). Zestawiono je w tabeli II.

Tabela II. Statystyczne parametry przydatności 14-tu badanych loci w medycynie sądowej

Table II. Statistical parameters of the usefulness of 14 loci in forensic medicine

Prostota metody reakcji PCR zarówno mono - jak i kompleksowej, a także korzystne parametry statystyczne 14-tu analizowanych loci genowych wskazują na wysoką przydatność tych markerów genetycznych w medycynie sądowej w badaniach identyfikacyjnych i w dochodzeniu ojcostwa.

PIŚMIENNICTWO

1. Allen R., Graves G., Budowle B.: "Polymerase chain reaction amplification products separated on dehybratable polyacrylamide gels and stained with silver". Biotechniques 1989, 7, 736-744. -2. Alonso A., Martin P., Albarran C., Sancho M., "Amplified fragment length polymorphism analysis of the VNTR locus D1S80 in central Spain". 1993, Int. J. Leg. Med. 105, 311-314. -3. Buscemi L., Cucurachi N., Mencarelli R., Sisti B., Tagliabracci A., Ferrara S.D.: "PCR typing of the locus D17S30 (YNZ 22 VNTR) in a Italian population sample". 1994, Int. J. Leg. Med. 106, 200-204. -4. Czarny J. Miścicka-Śliwka D., Berent J., Grzybow-ski T., Woźniak M.: "Ocena praktycznej przydatności multipleksowej analizy 12 loci STR zawartych w systemach "Gene Print Power Plex 1.2 Fluorescent STR System" i "Gene Print FFFL Fluorescent STR System" w dochodzeniu ojcostwa. Arch. Med. Sąd. Krym. 1999, XLIX, 225-231. -5. Garafano L., Pizzamiglio M., Vecchio C., Lago G., Floris T., D'Errico G., Brembilla G., Romano A., Budowle B.: "Italian population data on thirteen short tandem repeat loci: HUMTH01, D21S11, D18S51, HUMVWA31, HUMFIBRA, D8S1179, HUMTPOX, HUMCSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, D3S158". 1998, Forens. Sc. Int. 97, 53-60. -6. Gene M., Hugnet E., Sanchez-Garcia C, Moreno P., Corbella J., Mezquita J.: "Suitability of the YNZ22 (D17S5) VNTR polymorphism for legal medicine investigations in the population of Catalonia". Int. J. Med. 1955, 107, 222-224. -7. Gutowski S., Budowle B., Auer J., van Oorschot R.: "Statistical analysis of an Australian population for the loci Gc, HLA-DQA1, D1S80 and HUMTH01", 1995, Forens. Sc. Int. 76, 1-6. -8. Halos S.C., Chu J.Y., Ferreon A.C.M., Magno M.M.F.: "Philippine population database at nine microsatellite loci for forensic and paternity applications". 1999, Forens. Sc. Int. 101, 27-32. -9. Klintschar M., Al.-Hammadi N., Reichenpfoder B.: "Population genetic studies on the tetrameric short tandem repeat loci: D3S1358, VWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317 and D7S820 in Egypt". 1999, Forens. Sc. Int. 104, 23-31. -10. Lahiri K., Nurnberger J.: "A rapid non-enzymatic method for the preparation of HMWDNA from blood for RFLP studies". Nucleic Acids Research 1991, 19, 5444.
11. Maviglia R., Dobosz M., Boschi I., Caglia A., Hall D., Capelli C., d'Aloja E., Pescarmona M., Moscetti A., Pascali V.L, Destro-Bisol G.: "A repository of 14 PCR-loci Italian gene frequencies in the world wide web". 2001, Forens. Sc Int. 115, 99-101. -12. Miścicka-Śliwka D., Czarny J., Grzybowski T., Woźniak M.: "Population genetic of the STRs vWA, TH01, TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, LPL, F13B, FESFPS, F13A01, ACTBP2 in the Pomerania - Kujawy region of Poland. Forensic Sc. Internat. 2001, 119, 119-122. -13. Nagai A., Yamada S., Watanabe Y., Bunal Y., Ohya I.: "Analysis of the STR loci HUMF13A01, HUMFXIIIB, HUMLIPOL, HUMTH01, HUMTPOX and HUMVWA31 in Japanese population". 1996, Int. J. Leg. Med. 109, 34-36. -14. Pawłowski R., Dettlaff-Kąkol A., Jezierski G., Maciejewska A., Paszkowska R., Reichert M.: "Genetyka populacyjna dziewięciu loci typu STR z zestawu Profiler Plus w próbce populacji z obszaru Polski". Arch. Med. Sąd. Krym. 2000, L, 207-213. -15. Pestoni C., Garcia-Rivero A., Bellas S., Lareu M.V., Rodriguez-Calvo M.S., Barros F., Munoz I., Carracedo A.: "Allele frequency distribution of 15 PCR-based DNA polymorphisms in the population of Galicia (NW SPAIN)". -16. Turowska B., Sanak M., Opolska-Bogusz B.: "Wstępne badania populacji Polski Południowej w zakresie 10 STR loci z zestawem AmpFISTR SGM Plus". Arch. Med. Sąd. Krym., 2001, L. 93-96. -17. Santos S., Budowle B., Smerick J., Keys K., Moretti T.: "Portuguese population data on six short tandem repeat loci - CSF1PO, TPOX, TH01, D3S1358, VWA and FGA". 1996, Forens. Sc. Int. 83-229. -18. Takeshita H., Meyer E., Brinkmann B.: "The STR Loci HUM hTPO and HumLPL: population genetic data in eight populations". -19. Xiao F.X., Gilissen A., Gu X.X., Cassiman J.J., Decorte R.: "Genetic data obtained for two Chinese Han populations with a quadruplex fluorescent STR typing system (HUMVWA, HUMTH01, D21S11 and HPRT)". 1998, Int. J. Leg. Med. 111, 343-345. -20. Zupanic J., Balazic J., Komel R.: "Analysis of nine short tandem repeat (STR) loci in Slovenian Population". 1998, Int. J. Leg. Med., 111, 248.

Adres pierwszego autora:
Katedra i Zakład Medycyny Sądowej
ul. Curie Skłodowskiej 3A
80-210 Gdańsk