Wpływ metody izolacji DNA na stosunek wysokości alleli X i Y genu amelogeniny systemu Profiler Plus

^* Z Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej AM w Gdańsku

Kierownik: dr hab. Z. Szczerkowska - profesor AM

^** Z Instytutu Ekspertyz Sądowych w Krakowie

Dyrektor: Aleksander Głazek

Celem pracy było zbadanie wpływu metody izolacji DNA oraz warunków elektroforezy kapilarnej na stosunek alleli X i Y amelogeniny. Analiza stosunku wysokości alleli X i Y genu amelogeniny przy użyciu trzech różnych metod izolacji wykazała, iż metoda fenol-chloroform daje najbardziej zróżnicowane relacje wysokości tych alleli. Jedynie dla tej metody stwierdzono skrajny przypadek, gdzie stosunek obu alleli był niższy od 60%. Dla pozostałych dwóch metod izolacji, minimalny stosunek obu alleli nie spadał poniżej 79%. Analizując profile DNA w aspekcie istnienia potencjalnej mieszaniny należy zwrócić uwagę na rodzaj zastosowanej metody izolacji DNA.

The main aim of our study was the analysis of the influence of DNA isolation methods and capillary electrophoresis conditions on the ratio of amelogenin alleles. Three different DNA isolation methods were compared (phenol-chlorophorm (F-CH), Chelex and Blood DNA prep Plus). It was shown that the phenol-chlorophorm method gives the highest differences between X and Y allel ratios. It was observed that using the F-CH method it is possible to obtain a very low Y:X ratio (below 60%). In the case of two other methods the X:Y ratio was not lower than 79%. It was found that allele ratios of heterozygotes depend on the isolation DNA method used.

Słowa kluczowe: ProfilerPlus, mieszaniny DNA, zasady TWGDAM, metody izolacji DNA

WSTĘP

Wśród wielu opracowanych modyfikacji metody PCR szczególnie przydatna do badania śladów biologicznych okazała się reakcja kompleksowego PCR, której głównymi zaletami są: możliwość uzyskania w krótkim czasie dużej liczby informacji o badanym DNA oraz zmniejszenie zużycia matrycowego DNA. Do badań identyfikacyjnych w genetyce sądowej systemy kompleksowego PCR stosowane są od 1993 r. Pierwszym takim systemem wprowadzonym do praktyki medyczno-sądowej był quadruplex zawierający loci: TC11, VWA, F13A i FES (4, 5). W 1997 r. opracowano dekaplex AmpFLSTR Profiler Plus (9). Zgodnie z zaleceniami amerykańskiego TWGDAM każdy system wprowadzony do praktyki medyczno-sądowej wymaga szczegółowego zweryfikowania jego przydatności oraz poznania czynników wpływających na jego wiarygodność i niezawodność (10). Ponieważ w praktyce medyczno-sądowej materiał badawczy stanowią często ślady biologiczne będące mieszaninami DNA, dlatego też, do jednych z głównych zasad TWGDAM należy między innymi poznanie zakresu w jakim mieszczą się wysokości "stutterów" w stosunku do wysokości właściwych alleli loci badanego systemu oraz wzajemne stosunki alleli heterozygot, w tym również stosunek allela Y do X genu amelogeniny (1, 7, 11). Poznanie zakresu tych wartości pozwoli na prawidłową interpretację mieszanych plam biologicznych. Zakres wysokości frakcji "stutter" w stosunku do wysokości właściwych alleli loci systemu Profiler Plus przedstawiono we wcześniejszej publikacji (8).

MATERIAŁY I METODY

Trzydzieści doświadczalnych plam krwi (pobranej od jednego mężczyzny) sporządzono na czystej, wygotowanej bawełnie. Plamy do momentu badania przechowywano przez 1 tydzień w temperaturze i wilgotności pokojowej.

Izolację DNA z doświadczalnych plam krwi prowadzono metodą fenol -chloroform (F/CH) (13), Chelex-100 (12) i Blood DNA Prep Plus (A@A Biotechnology, Gdańsk) izolując każdą z nich po 10 plam krwawych. Ilość DNA w badanych próbkach oznaczano metodą hybrydyzacji z sondą swoistą dla ludzkiego DNA (QuantiBlot, Applera, USA) z zastosowaniem chemiluminescencyjnej metody detekcji (ECL, Amersham).

Amplifikację locus amelogeniny wchodzącego w skład zestawu Profiler Plus oraz rozdział produktów PCR prowadzono na automatycznym sekwenatorze DNA ABI310 (Applera, USA) w warunkach opisanych uprzednio (8). Do amplifikacji używano optymalnego stężenia DNA (1,25ng DNA /25m L mieszaniny PCR).

Analizie poddano po 10 elektroforegramów otrzymanych dla każdej metody izolacji badając stosunki alleli X i Y amelogeniny. Analizę przeprowadzano zarówno mierząc stosunek wysokości, jak i stosunek pól obu alleli, nie stwierdzając znamiennych różnic. Stosunek alleli wyrażano procentowo przyjmując za 100% wysokość wyższego allela.

Ten sam produkt PCR (10m L) zmieszano ze 120m L dejonizowanego formamidu oraz 10m L standardu wewnętrznego (GS500 ROX), a następnie rozdzielono na 10 probówek, zdenaturowano i każdy z nich poddano rozdziałowi na tej samej kapilarze i w tych samych warunkach (każdą próbkę nastrzykiwano na kapilarę przez 5 sekund). Analizując wyniki obliczono średni stosunek wysokości alleli X i Y oraz rozrzut (SD) stosując arkusz kalkulacyjny Excel 8.

7m L tego samego produktu PCR zmieszano z 84m L dejonizowanego formamidu oraz z 7m L standardu wewnętrznego (GS500 ROX). Następnie mieszaninę rozdzielono na 7 probówek i po denaturacji każdą z nich nastrzyknięto na tą samą kapilarę przy różnych czasach elektrokinetycznego pobrania próbki (od 3 do 9 sekund).

WYNIKI I OMÓWIENIE

Wraz z zastosowaniem technik badania DNA, a szczególnie PCR, wielokrotnie wzrosła liczba mieszanin wykrywanych w śladach biologicznych. Prawidłowa analiza mieszanych profili DNA wymaga między innymi poznania zakresu różnic w wysokościach alleli heterozygot. Przyjmuje się, że jeżeli wysokość frakcji typu "stutter" (n-4) przekracza 15 % wysokości głównego allela i/lub stosunek wysokości alleli dla heterozygoty jest mniejszy niż 70%, prawdopodobne jest, że badana próbka jest mieszaniną DNA (1, 2, 3, 11).

Z naszych wstępnych obserwacji laboratoryjnych wynika, iż stosunek wysokości alleli w heterozygocie dla próbek nie będących mieszaninami DNA, może zależeć między innymi od rodzaju użytej metody izolacji DNA. Aby potwierdzić lub obalić przypuszczenie wykonano serię doświadczeń pozwalających na zweryfikowanie czy istotnie rodzaj metody izolacji DNA ma znamienny wpływ na stosunek wysokości alleli heterozygot.

W celu zbadania wpływu rodzaju metody na stosunek alleli X i Y amelogeniny, po 10 identycznych plam krwi mężczyzny poddano izolacji metodą fenol-chloroform, metodą Chelex-100 i Blood DNA Prep Plus a następnie amplifikacji z zastosowaniem zestawu ProfilerPlus. Produkty PCR po rozdziale na automatycznym sekwenatorze DNA ABI310 poddano ilościowej analizie, badając stosunek alleli X i Y amelogeniny. Tabela I przedstawia zestawienie obserwowanych stosunków wysokości alleli amelogeniny w zależności od użytej metody izolacji DNA.

Tabela I. Porównanie stosunków alleli X i Y genu amelogeniny amplifikowanego

z DNA wyizolowanego z plam krwi trzema różnymi metodami.

Table I. Comparison of amelogenine allele ratios amplified from DNA isolated

using 3 different methods

Legenda: N.O. - nie obserwowano, (not observed)

Przy zastosowaniu metody fenol-chloroform obserwowano zarówno silniejszą amplifikację allela X od Y (6/10), jak i sytuację odwrotną (4/10). Minimalna procentowa wysokość allela Y nie stanowiła mniej niż 59,8% wysokości allela X. W odwrotnej sytuacji (4/10), gdy sygnał amplifikacyjny X był niższy od allela Y minimalna procentowa wysokość allela X nie stanowiła mniej niż 76,7%. Średnia wartość Y/X dla metody fenol-chloroform wynosiła 86,2%.

Dla metody Blood DNA Prep Plus również obserwowano silniejszą amplifikację allela X od Y (7/10), jak i sytuację odwrotną (3/10). Minimalna procentowa wysokość allela Y nie stanowiła mniej niż 79,7% wysokości allela X. W odwrotnej sytuacji (3/10), gdy sygnał amplifikacyjny X był niższy od allela Y minimalna procentowa wysokość allela X nie stanowiła mniej niż 98,10%. Średnia wartość Y/X dla metody Blood DNA Prep Plus wynosiła 96,4%.

W przypadku zastosowania Chelex-100, jako metody ekstrakcji DNA, obserwowano jedynie silniejszą amplifikację allela X od Y. Jego minimalna procentowa wysokość nie stanowiła mniej niż 79,2% wysokości allela X. Średnia wartość stosunku Y/X dla metody Chelex-100 wynosiła 88,6% i była zbliżona do wartości uzyskanej przez Lafautaina i wsp. (6) dla alleli X i Y genu amelogeniny wchodzącego w skład zestawu Green I (Applera, USA).

Teoretycznie, ze względu na małą różnicę w wielkości alleli X i Y amelogeniny (104pz, 109pz), proporcja ich sygnałów amplifikacyjnych powinna być zbliżona do 1:1. Pomimo niewielkiej różnicy w długości powielanych alleli obserwowano, w zależności od użytej metody, nie tylko przypadki preferencyjnej amplifikacji allela X ale również i sytuację odwrotną (Y>X). Porównanie trzech metod izolacji DNA (F/Ch, Chelex-100, Blood DNA Prep Plus) wykazało, że największe różnice w sygnałach amplifikacyjnych obu alleli amelogeniny daje metoda fenol- chloroform a najbardziej zbalansowane sygnały amplifikacyjne uzyskiwano dla metody Blood DNA Prep Plus. W związku z tym powinna być ona stosowana w sytuacjach, gdy szczególnie istotne jest wiarygodne określenie stosunku X:Y.

Aby właściwie zinterpretować uzyskane wyniki określono rozrzut metody (precyzję). W tym celu 10-krotnie nastrzyknięto na kapilarę ten sam produkt PCR. W wyniku stosownych obliczeń stwierdzono, że odchylenie standardowe dla stosunku X:Y tej analizy wynosi 0.0499 (4.99%). Tym samym oznacza to, iż można uznać średnie stosunki X:Y dla metody fenol-chloroform i dla metody Blood DNA Prep jako znamiennie różne. Z tego też powodu interpretując mieszane profile DNA należy brać pod uwagę rodzaj metody użytej do wyizolowania DNA, gdyż jak pokazano wzajemne relacje alleli wyraźnie zależą od zastosowanej metody ekstrakcji. Wzajemne porównania pozostałych metod nie pozwala na wyciągnięcie znamiennych statystycznie wniosków. Najbardziej zrównoważone stosunki alleli X:Y uzyskiwano izolując DNA metodą Blood DNA Prep plus. Jednak, tak jak i inne metody, daje ona w zależności od rodzaju badanych śladów mniej lub bardziej zadawalające wyniki.

Nieznana jest przyczyna tego rodzaju różnic stosunku X:Y. Nie należy jednak oczekiwać, iż powodem tego może być różnica wielkości (6pz) lub sekwencji alleli (homologia ponad 90%).

Inną, istotną, rzeczą jest fakt zaobserwowania dla metody F-CH stosunku alleli Y:X poniżej 60%, co dla próbki DNA nie będącej mieszaniną jest zjawiskiem dotychczas nie obserwowanym.

W celu zbadania na ile czas nastrzyku próbki na kapilarę ma wpływ na stosunek wysokości alleli X i Y, ten sam produkt PCR nastrzykiwano na kapilarę przez różny czas w zakresie od 3 do 9 sekund. Rycina 1 przedstawia uzyskaną zależność.

Ryc. 1. Wpływ czasu nastrzyku próbki na stosunek sekwencji Y/X genu amelogeniny

RFU - względne jednostki fluorescencji

Fig. 1. Influence of the injection time on amelogenin Y:X allele ratio

RFU - relative fluorescence units

Stwierdzono, że wraz ze zwiększeniem czasu nastrzyku wzrastał sygnał amplifikacyjny zarówno dla allela X i Y nie prowadząc do znamiennych zmian stosunku Y/X genu amelogeniny (Y/X dla 3 sek.: 83%, dla 9 sek.: 85%). Największą różnicę zaobserwowano dla 3 i 4 sekund nastrzyku (83%) a najmniejszą dla 7 sekund. Różnice te nie są jednak znamienne statystycznie (SD = ± 4.99%).

Reasumując można stwierdzić, iż na wzajemny stosunek alleli heterozygot ma wpływ rodzaj zastosowanej metody izolacji DNA, co tym samym może rzutować na prawidłową interpretację profilu DNA. Nie stwierdzono znamiennych statystycznie różnic stosunku alleli X i Y amelogeniny w zależności od czasu nastrzyku próbki na kapilarę.

PIŚMIENNICTWO

1. Gill P., Sparkes R., Kimpton C.: Development of guidelines to designate alleles using an STR multiplex systems. Forensic Science International., 1997, 89, 185-197. -2. Gill P., Sparkes B., Buckleton J. S.: Interpretation of simple mixtures of when artifacts such as stutters are present- with special reference to multiplex STRs used by the Forensic Science service. Forensic Science International., 1998, 95, 213-224. -3. Gill P., Sparkes R., Pinchin R., Clayton T., Whitaker J., Buckleton J.: Interpreting simple STR mixtures using allele peak areas. Forensic Science International., 1998, 91, 41-53. -4. Kimpton C. P., i wsp.: Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Meth. Appl., 1993, 3, 13-22. -5. Kimpton C. P., Fisher D., Watson S., Adams M., Urquhart A., Lygo J. E., Gill P.: Evaluation of an automated DNA profiling system employing multiplex of four tetrameric STR loci. Int J Leg Med., 1994, 106, 302-311. -6. LaFoutain M., Schwartz M., Cormier J., Buel E.: Validation of Capillary Electrophoresis for Analysis of the homologous Amelogenin Gene. Journal Forensic Sci., 1998, 43, 1188-1194. -7. Lygo J. E., Johnson P. E., Holdaway D. J., Woodroffe S., Whitaker J. P., Clayton T. M., Kimpton C. P., Gill P.: The validation of short tandem repeat (STR) loci for use in forensic casework. Int J Leg Med., 1994, 107, 77-89. -8. Pawłowski R, Maciejewska A.: Forensic validation of a multiplex containing nine STRs-population genetics in Northern Poland. Int J Leg Med., 2000, 114, 45-49. -9. Perkin Elmer. Applied Biosystem.: User's manual, AmpFlSTR Profiler Plus, PCR Amplification Kit., 1997. -10. Technical Working Group on DNA Analysis Methods.: Guidelines for a quality assurance program for DNA analysis. Crime Laboratory Digest., 1995, 22, 21-43.

11. Wallin J. M., Walsh P. S., Buonocristiani R., Lazaruk.K. D., Fildes N., Holt C. L.: TWGDAM Validation of the AmpFISTR Blue PCR Amplification Kit for Forensic Casework Analysis. J Forensic Sci., 1998, 43, 854-870. -12. Walsh S., Metzger D. A., Higuchi R.: Chelex-100 as a medium for simple exstraction of DNA for PCR - based typing from forensic material. Biotechniques., 1991, 10, 506-513. -13. Wiegand P., Schurenkamp M., Schutte U.: DNA extraction from mixtures of body fluid using mild preferential lysis. Int. J Leg Med., 1992, 104, 359-360.

Adres pierwszego autora:

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej

80-210 Gdańsk

ul. Curie-Skłodowskiej 3A