Renata Jacewicz, Stefan Szram, Wiesława Dudek

Pozorne wyłączenie macierzyństwa w lokus D1S80^*

The maternity pseudoexclusion in the D1S80 locus.

Z Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej AM w Łodzi

Kierownik: prof. dr hab. med. S. Szram

Podczas wykonywania rutynowej analizy w sprawie dochodzenia ojcostwa ujawniono rzadki przypadek mutacji w lokus D1S80, widocznej jako ubytek dwóch jednostek sekwencji repetatywnej.

After examing routine paternity cases the rare event of mutation in the D1S80 locus in the shape of the loss of two numbers of repeat units was observed.

Słowa kluczowe: lokus D1S80, analiza AmpFLP, przypadek mutacji, sądowe badania DNA.

Key words: D1S80 locus, Amp-FLP analysis, mutation event, forensic DNA typing.

WSTĘP

Lokus D1S80 należy do sekwencji VNTR (variable number repeat) typu minisatelitarnego. Zlokalizowany jest na krótkim ramieniu pierwszego chromosomu człowieka (6). Podstawowa 16 nukleotydowa sekwencja powtarza się w lokus zwykle od 14 do 41 razy, co warunkuje występowanie ok. 30 różnych alleli w populacji w przedziale wielkości 387-814 pz.

Układ D1S80 należy do chętnie i często wykorzystywanych w badaniach ojcostwa oraz w identyfikacji śladów biologicznych z uwagi na swoistość gatunkową dla człowieka, łatwość amplifikacji, wysokie wskaźniki: heterozygotyczności, siły dyskryminacji, szansy wyłączenia (1, 5, 10, 14, 15) oraz niski poziom mutacji (3, 7, 8, 11)

W niniejszym opracowaniu przedstawiono rzadki przypadek mutacji w układzie D1S80, gdzie różnica między allelem wyjściowym i zmutowanym przekracza jedną jednostkę repetatywną.

OPIS PRZYPADKU I OMÓWIENIE

DNA z pobranych prób krwi od pozwanego, matki i dziecka w sprawie o dochodzenie spornego ojcostwa (nr 36 D/ 96) izolowano stosując metodę solną (9). Amplifikację prowadzano przy użyciu zestawu Ampli FLP D1S80 firmy Perkin Elmer. Fragmenty D1S80 rozdzielano metodą wertykalnej elektroforezy w buforze 0,5 x TBE w polakrylamidowym żelu natywnym Gene Amp ^TM Detection firmy Perkin Elmer oraz poliakrylamidowym żelu denaturującym Gene Page Plus firmy Amresco. Żele barwiano metodą srebrową (2, 12, 13). Wielkość fragmentów oceniano w porównaniu z firmowym markerem wielkości - Allelic Ladder.

Oznaczenia systemów MLP i SLP przeprowadzono z zastosowaniem trawienia restryktazą Hinf I oraz hybrydyzacji z próbami molekularnymi firmy Cellmark Diagnostics. Po chemiluminescencyjnej detekcji uzyskane wielkości fragmentów DNA obliczano w odniesieniu do wzorca Nice ^TM DNA Analysis firmy Gibco BRL. Zastosowano do tego celu oprogramowanie komputerowe BIO 1D firmy Vilber Lourmat.

W analizie lokus D1S80 stwierdzono brak segregacji fragmentów DNA między matką a dzieckiem (Ryc. 1). Różnica dwu jednostek repetatywnych między najbliżej od siebie położonymi fragmentami dziecka i matki wskazywała na wyłączenie macierzyństwa.

Dalsze badanie w tej sprawie zostało przeprowadzone w oparciu o układ multilokusowy: 33,15 oraz układy jednolokusowe: D7521, D12S11, D1S7, D5S110, D2S44 i D7S22.

Badanie MLP przy użyciu sondy molekularnej 33.15 oraz enzymu restrykcyjnego Hinf I przedstawiono na rycinie 2, a wielkości fragmentów zmierzonych dla poszczególnych układów SLP podano w tabeli I.

Analiza dziedziczenia fragmentów DNA, przeprowadzona w wysoce polimorficznych regionach VNTR, wskazuje na to, że badana kobieta jest biologiczną matką badanego dziecka.

Opisany przypadek mutacji w układzie D1S80 jest drugim, uzyskanym po przeanalizowaniu 174 spraw spornego ojcostwa, w populacji centralnej Polski.

Ryc. 1. Amplifikowane fragmenty układu D1S80 w sprawie 36D/96 po wybarwieniu srebrem: a) żel natywny PAA, b) żel denaturujący PAA.

AL - wzorzec wielkości
p - domniemany ojciec : 18-26
dz - dziecko : 18-29
m - matka : 24-31

Zmutowany allel sugerujący wyłączenie macierzyństwa oznaczono strzałką.

Fig. 1. Amplified fragments of the locus D1S80 in paternity case 36D/96 after silver staining : a) native PAA gel, b) denaturing PAA gel.

AL - allelic ladder,
p - putative father : 18-26
dz - child : 18-29
m - mother : 24-31

Mutated allele suggesting maternity exclusion is marked by arrows.

Ryc. 2. Badanie MLP - 33.15/Hinf I w sprawie 36D/96

AL - wzorzec wielkości
p - domniemany ojciec
dz - dziecko
m - matka

Fig. 2. MLP - 33.15/Hinf I investigation in paternity case 36D/96

AL - allelic ladder
p - putative father
dz - child
m - mother

Tabela I. Segregacja fragmentów DNA w sprawie 33D/96 w poszczególnych układach SLP.

Table I. Segregation of DNA fragments in paternity case 33D/96 in different SLP systems.

O fakcie, że mutacje w lokus D1S80, sugerujące fałszywe wyłączenia rodzicielstwa, nie są zjawiskiem odosobnionym, świadczy również inne doniesienie w piśmiennictwie polskim (4).

Opracowania te, zdaniem autorów, skłaniają do zachowania szczególnej ostrożności przy wykorzystywaniu układu D1S80 w badaniach sądowych przeprowadzanych w Polsce.

PIŚMIENNICTWO

1. Alonso A., Martin P., Albarran C., Sancho M.: Amplified fragmenth polymorphism analysis of the VNTR locus D1S80 in central Spain. Int. J. Leg. Med., 1993, 105, 311-314. - 2. Budowle B., Chakraborty R., Giusti A.M., Eisenberg A.J., Allen R.C.: Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE. Am. J. Hum Genet., 1991, 48, 137-144. - 3. Deka R., De Croo S., Jin L., Mc Carvey S., Rothhammer F., Ferrel R.E., Chakraborty R.: Population genetic characteristics of the D1S80 locus in seven human populations. Hum. Genet., 1994, 94, 252-258. - 4. Dobosz T., Dmochowska G., Kowalczyk E., Szczepaniak M., Jagielski J.: Przypadki "wewnętrznej sprzeczności" poszczególnych elementów ekspertyzy DNA w sprawach o ustalenie spornego ojcostwa. Post.Med.Sąd. i Krym. Red. B. Świątek, Z. Parkitna-Cegła, Wrocław 1997, 323-327. -5. Hochmeister M., Budowle B., Borer U.V., Dirnhofer R.: Swiss population data on the loci HLA-DQα, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8, Gc and D1S80, For. Sci. Int., 1994, 175-184. - 6. Kasai K., Nakamura Y., White R.: Amplification of a variable number of tandem repeats (VNTR) locus (pMCT 118) by the polymerase chain reaction (PCR) and its application to forensic science. J. For. Sci. 1990, 35, 1196-1200. - 7. Kloosterman A.D., Budowle B., Daselaar P.: PCR amplification and detection of the human D1S80 VNTR locus. Int. J. Leg Med., 1993, 105, 257-264. - 8. Kozioł P., Ciesielka M.: Ocena przydatności badań VNTR lokus D1S80 w sprawach spornego ojcostwa. Arch. Med. Sąd. Krym., 1994, 44, 459-465. - 9. Lahiri D.K., Nurnberger Jr. J. I.: A rapid non enzymatic method for RFLP studies. Nucleic Acids. Res., 1991, 19, 5444. - 10. Pawłowski R.: Polimorfizm lokus D1S80 człowieka w populacji Polski Północnej, badany techniką PCR. Arch. Med. Sąd. Krym., 1995, 45, 247-256.

11. Sajantila A., Budowle B., Ström M., Johnsson V., Lukka M., Peltonen L., Ehnoholm Ch.: PCR amplification of alleles at D1S80 locus: comparision of a finish and a north american caucasian population sample and forensic casework evaluation Am. J. Hum. Genet. 1992, 50, 816-825. - 12. Sajantila A., Lukka M.: Improved separation of PCR amplified VNTR alleles by a vertical polyacrylamide gel electrophoresis. Int. J. Leg. Med., 1993, 105, 355-359. - 13. Sambrook J., Fritsh E.F., Maniatis T.: Molecular cloning. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989, 11.23. - 14. Szczerkowska Z.: Celowość określania konwencjonalnych cech grupowych krwi w dochodzeniu ojcostwa w dobie badań molekularnych. Post. Med. Sąd. i Krym., Red. S. Szram, Łódź, 1999, V, 319-326, 1999. - 15. Thymann M., Nellemann L.J., Masumba G., Irgens - Möller L., Morling N.: Analysis of the locus D1S80 by amplified fragment lenght polymorphism technique (Amp - FLPp). Frequency distribution in Danes. Intra and inter labolatory reproducibility of the technique. For. Sci. Int., 1993, 60, 47-56.

Adres pierwszego autora:

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej AM

ul. Sędziowska 18 a

91-304 Łódź

Print